МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Інститут (факультет) __біотехнології та екологічного контролю__ Кафедра ______біотехнології і мікробіології__________ «До захисту в ЕК» «До захисту допущено» Декан факультету Завідувач кафедри __________ _Наталія ГРЕГІРЧАК_ (підпис) (ім’я та прізвище) _________ _Віктор СТАБНІКОВ_ (підпис) (ім’я та прізвище) «___» ____червня______ 2024 р. «___» ___червня_____ 2024 р. КВАЛІФІКАЦІЙНА РОБОТА НА ЗДОБУТТЯ ОСВІТНЬОГО СТУПЕНЯ БАКАЛАВРА зі спеціальності _______162 «Біотехнології та біоінженерія»_______________ (код та назва спеціальності) освітньо-професійної програми____ «Біотехнології: фармацевтична,_______ ____________________________промислова, харчова, природоохоронна»__ на тему: « Одержання білка одноклітинних Methylococcus capsulatus» Виконав: здобувач__IV__ курсу, групи__1___ ОЛЕКСІЄНКО Софія Валеріївна ______________________ (прізвище, ім’я, по батькові повністю) (підпис) Керівник _КРАСІНЬКО Вікторія Олегівна _______________________ (прізвище , ім’я та по батькові повністю) (підпис) Консультанти_________________ ___________ (ім’я та прізвище) (підпис) _________________ ___________ (ім’я та прізвище) (підпис) Рецензент __Маргарита ЛОМБЕРГ________ ___________ (ім’я та прізвище) (підпис) Я, як здобувач(ка) Національного університету харчових технологій, розумію і підтримую політику університету з академічної доброчесності. Я не надавав(-ла) і не одержував(-ла) недозволеної допомоги під час підготовки цієї роботи. Використання ідей, результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело Здобувач____________________ (підпис) Київ – 2024 р. НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Інститут (факультет) __Біотехнології та екологічного контролю_____________ Кафедра ______біотехнології і мікробіології____________________________ Освітній ступінь____бакалавр________________________________________ Спеціальність____162 «Біотехнології та біоінженерія»___________________ (код і назва) Освітньо-професійна програма __«Біотехнології: фармацевтична, промислова, харчова, природоохоронна»_________________. (назва) ЗАТВЕРДЖУЮ Завідувач кафедри біотехнології і__мікробіології________ ______Віктор СТАБНІКОВ_ “_01_” __березня__2024 року З А В Д А Н Н Я НА КВАЛІФІКАЦІЙНУ РОБОТУ ЗДОБУВАЧА _________________ ОЛЕКСІЄНКО Софії Валеріївні ____________ (прізвище, ім’я, по батькові) 1. Тема роботи «Одержання білка одноклітинних Methylococcus capsulatus» керівник роботи__ КРАСІНЬКО Вікторія Олегівна, кандидат технічних наук, доц., ( прізвище, ім’я, по батькові, науковий ступінь, вчене звання) затверджені наказом закладу вищої освіти від 29 березня 2024 року № 238-кс 2. Строк подання здобувачем роботи __28 травня 2024 р.____________________ 3. Вихідні дані до роботи біологічний агент: Methylococcus capsulatus NCIMB 11132, цільовий продукт: білок одноклітинних організмів. 4. Зміст пояснювальної записки (перелік питань, які потрібно розробити) _____ РОЗДІЛ 1. Характеристика цільового продукту. РОЗДІЛ 2. Обґрунтування вибору та характеристика біологічного агента. РОЗДІЛ 3. Техніко-економічне обґрунтування. РОЗДІЛ 4. Біосинтез цільового продукту. РОЗДІЛ 5. Обґрунтування вибору технологічної схеми. РОЗДІЛ 6. Специфікація обладнання. РОЗДІЛ 7. Опис технологічної схеми. 8. Післяферментаційні процеси виробництва білка. РОЗДІЛ 9. Контроль виробництва. РОЗДІЛ 10.Перспективи впровадження системи екологізації виробництва. 5. Перелік графічного матеріалу Технологічна схема– 1 аркуш (А1). Апаратурна схема – 1 аркуш формату (А2). 6. Консультанти розділів роботи Розділ Прізвище, ініціали та посада консультанта Підпис, дата завдання видав завдання прийняв 7. Дата видачі завдання___01.03.2024 р.________________________________ КАЛЕНДАРНИЙ ПЛАН № Назва етапів виконання кваліфікаційної роботи Строк виконання етапів роботи Примітка 1 Характеристика цільового продукту 01.03.24 – 08.03.24 2 Обґрунтування вибору та характеристика біологічного агента 09.03.24 – 15.03.24 3 Техніко-економічне обґрунтування. 16.03.24 – 21.03.24 4 Біосинтез цільового продукту. 22.03.24 – 30.03.24 5 Обґрунтування вибору технологічної схеми 01.04.24 – 10.04.24 6 Специфікація обладнання 11.04.24 - 19.04.24 7 Опис технологічної схеми 22.04.24 – 26.04.24 7 Післяферментаційні процеси виробництва білка 22.04.24 – 26.04.24 8 Контроль виробництва 29.04.24 – 10.05.24 9 Перспективи впровадження системи екологізації виробництва 13.05.24 – 17.05.24 10 Графічна частина 20.05.24 - 24.05.24 11 Оформлення кваліфікаційної роботи 25.05.24 – 28.05.24 Здобувач _______________ _____ Софія_ОЛЕКСІЄНКО_ _______ (підпис) (ім’я та прізвище) Керівник роботи _____________ ___ Вікторія КРАСІНЬКО _______ (підпис) (ім’я та прізвище) РЕФЕРАТ Кваліфікаційна робота присвячена отриманню та технологічному процесу біотехнологічного виробництва білка одноклітинних мікроорганізмів метилотрофної бактерії Methylococcus capsulatus NCIMB 11132, що вирощується із гетеротрофними бактеріями (ацетогеннами) Alcaligenes acidovorans, Aneurinibacillus danicus і Brevibacillus sp. Після проведення аналізу інформації, представленої у доступній літературі щодо потенційних продуцентів цільового продукту було обрано саме штам M. capsulatus NCIMB 11132, що вирощується у змішаній культурі. Вибір зумовлений тим, що синтез біомаси змішаною культурою був вищим у майже 4 рази, ніж відповідний показник для метилотрофної монокультури. Технологічна схема розробленого процесу біосинтезу білка одноклітинних мікроорганізмів включає в себе допоміжні роботи (підготовка титрувальних 6 %-их розчинів (сульфатної кислоти (H2SO4) та натрію гідроксиду (NaOH)), підготовка розчину мікроелементів та підготовка поживних середовищ (приготування і стерилізацію) для вирощування гетеротрофних мікроорганізмів, отримання посівного матеріалу та виробничого біосинтезу. Технологічний процес складається із наступних етапів: підготовки гетеротрофних культур, вирощування інокуляту у посівних апаратах об’ємами 10, 30 і 100 л та виробничого біосинтезу у газовому біореакторі об’ємом 300 л із коефіцієнтом заповнення 0,5. Дипломна робота складається зі вступу, десяти розділів, списку використаної літератури з 30 найменувань. Загальний обсяг роботи – 108 сторінок, 2 рисунка, 10 таблиць. Ключові слова: біомаса, мікробний білок, безперервне культивування, Methylococcus capsulatus NCIMB 11132, змішана культура, метилотрофи. ABSTRACT The thesis is devoted to the production and technological process of biotechnological production of protein by unicellular microorganisms of the methylotrophic bacterium Methylococcus capsulatus NCIMB 11132 grown with heterotrophic bacteria (acetogenic) Alcaligenes acidovorans, Aneurinibacillus danicus and Brevibacillus sp. After analysing the information presented in the available literature on the potential producers of the target product, the strain M. capsulatus NCIMB 11132, grown in mixed culture, was chosen. The choice was due to the fact that the biomass synthesis by the mixed culture was almost 4 times higher than the corresponding indicator for methylotrophic monoculture. The technological scheme of the developed process of protein biosynthesis of unicellular microorganisms includes auxiliary works (preparation of titration solutions of 6 % (sulfuric acid (H2SO4) and sodium hydroxide (NaOH)), preparation of microelements solution and preparation of culture media (preparation and sterilisation) for growing heterotrophic microorganisms, obtaining seed material and production biosynthesis. The technological process consists of the following stages: preparation of heterotrophic cultures, inoculum cultivation in 10, 30 and 100 litre sowing apparatus and production biosynthesis in a 300 litre gas bioreactor with a filling factor of 0.5. The thesis consists of an introduction, ten chapters, and a list of 30 references. The total volume of the work is 108 pages, 2 figures, 10 tables. Keywords: biomass, microbial protein, continuous cultivation, Methylococcus capsulatus NCIMB 11132, mixed culture, methylotrophs. ЗМІСТ ВСТУП .......................................................................................................................... 9 РОЗДІЛ 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ЦІЛЬОВОГО ПРОДУКТУ БІОСИНТЕЗУ ...................................................................................................................................... 11 РОЗДІЛ 2. ОБҐРУНТУВАННЯ ВИБОРУ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА БІОЛОГІЧНОГО АГЕНТА .................................................................................... 17 2.1. Обгрунтування вибору біологічного агента та поживного середовища для його культивування ...................................................................................... 17 2.3 Морфолого-культуральні та фізіолого-біохімічні ознаки біологічного агента ....................................................................................................................... 28 2.4.Таксономічний статус біологічного агенту................................................ 29 РОЗДІЛ 3. ТЕХНІКО-ЕКОНОМІЧНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ ........................... 31 3.1. Потреба у цільовому продукті ..................................................................... 31 3.2. Обрахунок річної потужності виробництва білка одноклітинних організмів ................................................................................................................ 33 3.3. Розрахунок необхідної кількості циклів для виробництва білку і геометричного об’єму газового біореактору .................................................... 35 3.4. Розрахунок потрібної кількості стадій підготовки посівного матеріалу ................................................................................................................................... 36 РОЗДІЛ 4. БІОСИНТЕЗ ЦІЛЬОВОГО ПРОДУКТУ ........................................ 40 РОЗДІЛ 5. ОБҐРУНТУВАННЯ ВИБОРУ ТЕХНОЛОГІЧНОЇ СХЕМИ ...... 43 5.1. Вибір умов і способу культивування ......................................................... 43 5.2. Вибір типу газового ферментера. ................................................................ 48 5.3. Обгрунтування вибору та опис стадій санітарної підготовки виробництва білка ................................................................................................ 52 5.4. Особливості підготовки і стерилізації поживного середовища для одержання посівного матеріалу і виробничого процесу ............................... 61 5.5. Розрахунок кількості стадій підготовки посівного матеріалу для біосинтезу одноклітинного білка M. capsulatus NCIMB 11132 ..................... 61 5.5. Особливості підготовки і стерилізації поживного середовища для вирощування інокуляту в колбах на качалках та інокуляторі на 10 л ..... 63 5.6. Особливості підготовки і стерилізації поживного середовища для вирощування інокуляту у посівних апаратах на 30 і 100 л .......................... 64 5.7. Особливості підготовки і стерилізації поживного середовища для виробничого біосинтезу у газовому біореакторі на 300 л.............................. 64 РОЗДІЛ 6. СПЕЦИФІКАЦІЯ ОБЛАДНАННЯ .................................................. 66 РОЗДІЛ 7. ОПИС ТЕХНОЛОГІЧНОЇ СХЕМИ ВИРОБНИЦТВА ................ 69 РОЗДІЛ 8. ПІСЛЯФЕРМЕНТАЦІЙНІ ПРОЦЕСИ ВИРОБНИЦТВА БІЛКА ...................................................................................................................................... 81 8.1. Обгрунтування стадій виділення і очищення мікробного білка.......... 81 8.1.1. Виділення клітин ..................................................................................... 82 8.1.2. Концентрування ....................................................................................... 85 8.1.3. Висушування ............................................................................................ 86 9.1.4. Стабілізація ............................................................................................... 88 8.1.5. Фасування та пакування мікробного білка ....................................... 89 РОЗДІЛ 9. КОНТРОЛЬ ВИРОБНИЦТВА .......................................................... 91 9.1. Мікробіологічний контроль ...................................................................... 91 9.2. Визначення концентрації біомаси метилотрофних бактерій ................ 94 9.3. Визначення концентрації біомаси гетеротрофних бактерій ................. 94 9.4. Визначення концентрації джерела вуглецю (газова суміш) ................. 95 9.5. Визначення концентрації джерела азоту (калію нітрату) ..................... 96 9.6. Визначення концентрації білку одноклітинних організмів .................. 97 9.7. Методи ідентифікації білка .......................................................................... 98 9.8. Визначення показників якості .................................................................... 99 9.9. Частка жиру та ліпідхих залишків у кінцевому продукті ................... 100 9.10. Оцінка біологічної дії ................................................................................ 104 9.11. Карта постадійного контролю ................................................................. 105 РОЗДІЛ 10. ПЕРСПЕКТИВИ ВПРОВАДЖЕННЯ СИСТЕМИ ЕКОЛОГІЗАЦІЇ ВИРОБНИЦТВА ..................................................................... 112 10.1 Системи знешкодження рідких відходів ................................................ 112 10.1.1 Розрахунки орієнтовного об’єму стічних вод .................................. 112 10.1.2. Визначаємо середні витрати стічних вод від промислового підприємства. .................................................................................................... 113 10.1.3. Система очищення стічних вод......................................................... 114 10.2. Системи знешкодження газоподібних відходів .................................... 115 10.3. Системи знешкодження твердих відходів ............................................. 116 СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ .................................................... 117 ВСТУП Агропромисловий комплекс має значний потенціал для виробництва біопалив, який досі залишається невикористаним у повній мірі. Виробництво біопалив із біомаси та відходів рослинницької і тваринницької продукції, харчових відходів дозволяє не лише зменшити емісію парникових газів за рахунок застосування безвідходних технологій виробництва енергії з біогазу, а й вирішити ряд інших питань щодо забезпечення енергетичної незалежності та автономізації виробництва, забезпечення продовольчої безпеки, екологічної безпеки і відновлення родючості ґрунтів України [1]. Традиційно гній безпосередньо використовується як добриво в сільському господарстві, що може спричинити екологічні проблеми, забруднення води та забруднення. Природне розкладання гною призводить до викидів метану та вуглекислого газу під час зберігання. Таке окиснення сприяє пом’якшенню запахів, пов’язаних зі зберіганням і розкладанням гною, і видаляє патогени, які можуть становити значний ризик для здоров’я людей і тварин [2]. Біомаса вирізняється тим, що, відмінно від інших джерел енергії, вона є універсальним ресурсом, придатним як для виробництва електроенергії та теплової енергії, так і для вироблення біопалива для транспортних потреб. У сучасний час скорочення використання природного газу є однією з найактуальніших тем для економіки України. Таким чином, пошук альтернативних джерел енергії та впровадження енергозберігаючих технологій стає нагальним завданням. Використання відновлюваних джерел енергії, зокрема біомаси, має важливе значення для України, оскільки це сприяє зменшенню залежності від імпортованих енергоносіїв і підвищує енергетичну безпеку країни [3]. Змн Лист № докум. Підпис Дата Арк. 8 НУХТ БТЕК 04.01.34 КР ПЗ мм Розроб. Олексієнко Красінько Керівник Рецензент Н.контр. Затверд. Стабніков В.П. ВСТУП .Літ. Аркушів 108 Кафедра БТМ Тому актуальним є пошук та подальша розробка шляхів перетворення відходів тваринницького комплексу в одне із джерел відновлювальної енергії – біогаз. Новизною ж даної роботи є використання змішаної культури M. capsulatus (Bath) NCIMB 11132 з гетеротрофними бактеріями (ацетогеннами) Alcaligenes acidovorans, Aneurinibacillus danicus і Brevibacillus sp., які у процесі росту на газовій суміші (метан+вуглекислий газ+повітря) здатні синтезувати мікробний білок. РОЗДІЛ 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ЦІЛЬОВОГО ПРОДУКТУ БІОСИНТЕЗУ Білок одноклітинних організмів (БОО) або мікробний білок отримують на основі культивування мікроорганізмів. Його отримують з інактивованих клітин мікроорганізмів, таких як дріжджі, бактерії, гриби та водорості. Одноклітинний мікробний білок служить харчовою або кормовою добавкою і може бути альтернативою звичайним джерелам білка. БОО містить високий вміст білка з усіма незамінними амінокислотами. Білок одноклітинних організмів має ряд переваг у порівнянні з традиційними джерелами білка, такими як м'ясо, риба або рослини. Він містить не лише всі незамінні амінокислоти, але також багатий на вітаміни, мінерали і біологічно активні речовини, що сприяють зміцненню імунної системи та поліпшенню загального стану здоров'я. Завдяки високій біодоступності, мікробний білок легко засвоюється організмом, що робить його цінним джерелом харчування для людей з різними дієтичними потребами, включаючи вегетаріанців і веганів. Культивування мікроорганізмів для отримання білка є екологічно чистим і ефективним методом виробництва харчових продуктів. Воно вимагає значно менше води, землі та енергії порівняно з традиційним тваринництвом, що допомагає зменшити вплив на довкілля та зменшити викиди парникових газів. Мікроорганізми можуть культивуватися на різних субстратах, включаючи відходи агропромислового комплексу, що додатково сприяє зменшенню відходів і підвищенню стійкості виробничих процесів. Змн Лист № докум. Підпис Дата Арк. 9 НУХТ БТЕК 04.01.34 КР ПЗ Розроб. Олексієнко Красінько Керівник Рецензент Н.контр. Затверд. Стабніков В.П. ХАРАКТЕРИСТИКА ЦІЛЬОВОГО ПРОДУКТУ БІОСИНТЕЗУ .Літ. Аркушів 108 Кафедра БТМ Крім того, технології виробництва мікробного білка постійно розвиваються, що дозволяє отримувати продукти з покращеними харчовими і органолептичними властивостями. Це відкриває нові можливості для створення інноваційних продуктів харчування, таких як м'ясні аналоги, білкові батончики та спортивні добавки. Використання БОО може відігравати ключову роль у вирішенні глобальних проблем продовольчої безпеки, забезпечуючи доступне та поживне джерело білка для зростаючого населення планети. З огляду на всі ці переваги, білок одноклітинних організмів має великий потенціал для подальшого розвитку та впровадження у харчову промисловість та тваринництво [7]. Вміст білка в інактивованих клітинах становить щонайменше 40% сирого протеїну на основі сухої ваги. Порівняно з іншими джерелами білків, такими як соя та рибне борошно, БОО показує переваги з точки зору коротшого часу виробництва, незалежності від погодних умов та нижчої вартості виробництва. Таким чином, БОО було визнано одним із потенційних рішень для вирішення глобальної нестачі продовольства через зростання населення. Виробництво мікробного білку має низькі вимоги до типу джерел вуглецю, і як джерела вуглецю, такі як відходи молочних продуктів, безсумнівно, є найбільш економічно доцільним для виробництва. Виробництво БОО може бути здійснене за допомогою ферментації, яка є високоефективним процесом, що дозволяє швидко і стабільно отримувати великі обсяги продукту. Основна характеристика, яка майже ніколи не згадується в літературі, стосується саме використання БОО для споживання людиною. Профіль смаку та аромату продукту БОО, призначеного для їжі, в ідеалі має бути приємним або принаймні нейтральним. Наприклад, рибний запах БОО мікроводоростей може обмежити його використання в багатьох харчових продуктах, якщо подальша обробка не проводиться. Розробка методів обробки, таких як дегідратація, ферментація або додавання ароматизаторів, може допомогти покращити органолептичні властивості БОО. Крім того, різні відходи в принципі придатні для виробництва БОО кормів, але споживачі не завжди можуть бути готові прийняти їх для виробництва їжі. Важливо проводити освітні кампанії, що підвищують обізнаність про безпечність та користь мікробного білка для здоров'я людини. Ця робота може сприяти зміні ставлення споживачів та підвищенню прийняття продуктів на основі БОО [8]. Мікробний білок також може бути збагачений додатковими поживними речовинами, такими як омега-3 жирні кислоти, вітаміни групи B та мікроелементи, що робить його ще більш корисним для здоров'я людини. Використання БОО у функціональних продуктах харчування може стати важливим кроком у розвитку індустрії здорового харчування та профілактики захворювань. Таким чином, впровадження БОО у харчову промисловість потребує комплексного підходу, включаючи вдосконалення технологій виробництва, покращення смакових якостей продукту та активну просвітницьку роботу серед споживачів. Це дозволить максимально реалізувати потенціал мікробного білка як стійкого та поживного джерела білка для зростаючого населення планети [9]. Одним із найвідоміших комерційних видів грибкових SCP отримано з Fusarium venenatum, який використовується для виробництва м’ясної альтернативи Quorn™, яка була запущена в 1985 році компанією Marlow Foods у Великобританії. Fusarium venenatum — це вид грибка, який характеризується високим вмістом білка та здатністю до ферментації в умовах контрольованого середовища. Процес виробництва Quorn™ включає вирощування Fusarium venenatum в біореакторах, де грибок забезпечується глюкозою, вітамінами і мінералами, необхідними для його росту. Після ферментації грибкові міцели збираються, обробляються і формуються у вигляді продуктів, що нагадують текстуру і смак м'яса. Quorn™ став популярним замінником м’яса завдяки високому вмісту білка, низькому вмісту насичених жирів і холестерину, а також екологічно чистому процесу виробництва [10]. Пивні дріжджі (Saccharomyces cerevisiae), які є побічним продуктом пивоварної промисловості, традиційно використовуються для виробництва дріжджових екстрактів, а також солоних дріжджових спредів Marmite®, Cenovis® і Vegemite®. Після завершення процесу бродіння у пивоварінні, дріжджі збираються та піддаються автолізу, що означає розщеплення клітин дріжджів власними ферментами. У результаті цього процесу утворюються дріжджові екстракти, багаті на білок, вітаміни групи B, зокрема B12, та інші корисні речовини. Marmite® є популярним у Великобританії дріжджовим спредом, який має густу консистенцію та інтенсивний смак. Cenovis® — аналогічний продукт, популярний у Швейцарії, а Vegemite® — відомий австралійський спред. Ці продукти широко використовуються як добавки до їжі для збагачення раціону білком і вітамінами, а також як інгредієнти в різних рецептах. Виробництво дріжджових екстрактів є ефективним способом утилізації побічних продуктів пивоваріння, зменшуючи відходи і забезпечуючи доступ до високоякісного джерела білка та поживних речовин. Вони є важливими компонентами вегетаріанської та веганської дієт, а також популярними серед людей, які шукають альтернативні джерела білка і вітамінів [11]. Розчинність мікробного білка залежить від кількох основних факторів. Один із них - це полярність розчинника. Полярні розчинники, такі як вода, ефективно розчиняють мікробні білки завдяки здатності утворювати водневі зв'язки та електростатичні взаємодії з полярними групами білкових молекул. У той час як неполярні розчинники, наприклад, гексан, не підходять для розчинення білків через відсутність сильних взаємодій з полярними групами білкових молекул. Інший важливий фактор - іонна сила. Додавання солей у розчин може змінювати розчинність білків. Низькі концентрації солей можуть підвищувати розчинність білка, завдяки ефекту "екранизації" зарядів, тоді як високі концентрації можуть спричинити випадання білка, що є наслідком ефекту "осолення". pH середовища також сильно впливає на заряд білкових молекул. Розчинність білків мінімальна при ізоелектричній точці (pI) білка, де сумарний заряд молекули дорівнює нулю. Зміщення pH від ізоелектричної точки може підвищувати розчинність через надання білковій молекулі заряду, що покращує її взаємодію з водними молекулами [12]. Температура впливає на структуру білка та його розчинність. Зазвичай, підвищення температури збільшує розчинність білка, але надмірне нагрівання може призвести до денатурації білка і втрати його розчинності. Процес розчинення мікробного білка починається з екстракції білка. Після культивування мікроорганізмів, наприклад, дріжджів або бактерій, клітини збирають і піддають лізису (руйнуванню клітинної стінки) для вивільнення внутрішньоклітинних білків. Це може бути здійснено хімічними, механічними або ферментативними методами. Після лізису клітин отриману суміш піддають очищенню для видалення небілкових компонентів. Цей етап може включати центрифугування, фільтрацію та діаліз. Очищення також може включати хроматографічні методи, такі як іонообмінна або гель-фільтраційна хроматографія, для досягнення високої чистоти білка. Отриманий білковий розчин може бути концентрований шляхом ультрафільтрації або осмотичного випаровування. Остаточна форма продукту може бути у вигляді порошку, який отримують шляхом сушіння, наприклад, розпилювальним або ліофілізаційним методом [12]. Розчинення мікробного білка у воді або іншому харчовому розчиннику залежить від його кінцевої форми та процесу підготовки. Наприклад, порошковий білок може легко розчинятися у воді, якщо він добре очищений і не містить денатурованих фракцій. Для використання у харчових продуктах або кормах мікробний білок повинен бути добре розчинним у водних системах, щоб забезпечити однорідність суміші та біодоступність поживних речовин. Розчинність також впливає на текстуру і смакові властивості кінцевого продукту. Тому важливо контролювати умови розчинення, такі як pH, температура та іонну силу розчину [13]. РОЗДІЛ 2. ОБҐРУНТУВАННЯ ВИБОРУ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА БІОЛОГІЧНОГО АГЕНТА 2.1. Обгрунтування вибору біологічного агента та поживного середовища для його культивування Мікроорганізми-продуценти білків відзначаються дуже високою інтенсивністю накопичення біомаси, яка в 500-5000 разів вище, ніж у рослин або тварин. Мікробні клітини здатні накопичувати дуже великі кількості білка (дріжджі - до 60 %, бактерії - до 75 % за масою). Коливання вмісту білка у сухій речовині біомаси мікроорганізмів може складати від 19 до 90 % (табл 2.1) [14]. Таблиця 2.1. Вміст речовин у сухій клітинній біомасі (у відсотках) Склад Гриби Водорості Дріжджі Бактерії Білки 30-45 40-60 45-55 50-65 Жири 2-8 7-20 2-6 1-3 Зола 9-14 8-10 5-10 3-7 Нуклеїнові кислоти 7-10 3-8 6-12 8-12 Мікроорганізми як продуценти білків мають кілька переваг: Швидкість розмноження: Мікроорганізми, такі як дріжджі і бактерії, мають дуже короткий час розмноження. Це означає, що їх можна швидко вирощувати в великих кількостях. Це особливо важливо в промислових процесах, де великі обсяги білків потрібні для виробництва ліків, ферментів або інших продуктів. Змн Лист № докум. Підпис Дата Арк. 12 НУХТ БТЕК 04.01.34 КР ПЗ Розроб. Олексієнко Красінько Керівник Рецензент Н.контр. Затверд. Стабніков В.П. ОБҐРУНТУВАННЯ ВИБОРУ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА БІОЛОГІЧНОГО АГЕНТА .Літ. Аркушів 108 Кафедра БТМ - Високий вихід білка: Мікроорганізми можуть накопичувати великі кількості білка відносно до своєї сухої речовини. Це означає, що вони ефективно використовують ресурси для синтезу білка і можуть забезпечувати високу вихідну продуктивність. - Легкість культивування: Більшість мікроорганізмів легко культивувати в лабораторних умовах. Вони можуть рости на простих поживних середовищах і не потребують складних умов або дорогих ресурсів для збереження їх життєздатності. - Генетичні модифікації: Мікроорганізми можуть бути генетично модифіковані для покращення їх продуктивності, вмісту білка або інших властивостей. Це дозволяє створювати спеціалізовані штами, які ефективно виробляють білки заданого типу або зокрема змінені властивості. - Економічність: Виробництво білків мікроорганізмами може бути економічно вигідним. - Масштабованість: Виробництво білків з використанням мікроорганізмів може бути легко масштабоване від лабораторного масштабу до промислового рівня. Це означає, що виробництво може бути збільшене для задоволення великого попиту на білки без суттєвих змін у технології або витратах. - Гнучкість вибору джерела: Мікроорганізми можуть бути використані для виробництва білків з різних джерел. Наприклад, вони можуть синтезувати білки, що походять з рослин, тварин або навіть інших мікроорганізмів. Це дає можливість вибирати оптимальні джерела білків для конкретних потреб [15]. - Виробництво складних білків: Мікроорганізми можуть бути програмовані для виробництва складних білкових структур, включаючи глікопротеїни та інші похідні білки. Це особливо важливо в фармацевтичній і медичній галузях, де складні білки мають велике значення для розробки ліків та терапевтичних препаратів. - Біологічна сумісність: Мікроорганізми, які виробляють білки, можуть бути біологічно сумісними з організмами, включаючи людину. Це спрощує процеси клінічних випробувань і дозволяє швидше впровадження білкових продуктів у медицину. Види бактерій, які використовують для росту газоподібні одновуглецеві субстрати, включають аеробні та анаеробні бактерії, що окиснюють водень, і метанотрофи. Існує кілька видів бактерій, які можуть використовувати газоподібні одновуглецеві субстрати для свого росту. Декілька таких видів бактерій включають: - Аеробні бактерії, що окиснюють водень: Ці бактерії використовують молекулярний водень (H2) як джерело енергії. Вони здатні до аеробного дихання і споживають кисень для окиснення водню. Результатом цього процесу є утворення води (H2O). - Анаеробні бактерії, що окиснюють водень: Ці бактерії також використовують молекулярний водень як джерело енергії, але вони функціонують у відсутності кисню. Вони здатні до анаеробного дихання і використовують альтернативні електрон-акцептори, такі як нітрати або сульфати, для окиснення водню [5]. - Метанотрофи: Це бактерії, які споживають метан (CH4) як джерело вуглецю і енергії. Вони використовують спеціальні ферменти, відомі як метанмонооксигенази, для окиснення метану. Цей процес є важливим у природних екосистемах, таких як болота і морські днища. - Використання цих бактерій для росту на газоподібних одновуглецевих субстратах може мати практичне значення. Наприклад, аеробні та анаеробні бактерії, що окиснюють водень, можуть бути використані для очищення стічних вод або виробництва водню як відновлюваного джерела енергії. Метанотрофи використовуються для обробки відходів та виробництва біопалива з метану. Загалом, ці бактерії, які використовують газоподібні одновуглецеві субстрати, мають велике значення в біотехнології та екології. Ось кілька додаткових аспектів, пов'язаних з цими бактеріями: - Біогазове виробництво: Анаеробні бактерії, що окиснюють водень, та метанотрофи є ключовими гравцями в процесі біогазового виробництва. Вони використовуються для перетворення органічних матеріалів, таких як стічні води, компости або сільськогосподарські відходи, у біогаз, що складається переважно з метану та вуглекислого газу. Біогаз може бути використаний як джерело енергії для опалення, електропостачання або виробництва палива для транспорту [6]. - Біоремедіація: Деякі з цих бактерій можуть бути використані для біоремедіації, тобто очищення забруднених середовищ від токсичних речовин. Наприклад, деякі анаеробні бактерії можуть біологічно перетворювати хлорорганічні сполуки, такі як трихлорметан або трихлоретилен, на менш токсичні продукти. - Біопалива: Використання метанотрофів для виробництва біопалив на основі метану є об'єктом активних досліджень. Ці бактерії можуть ефективно використовувати метан як джерело вуглецю для синтезу цінних органічних сполук, таких як біопластики або хімічні речовини. - Біологічний цикл вуглецю: Метанотрофи мають важливу роль в природному циклі вуглецю. Вони споживають метан, який виробляється різними процесами, включаючи природні джерела, такі як болота, рисові поля, склади відходів, а також антропогенні джерела, такі як енергетичні та промислові установки. Цей процес допомагає контролювати концентрацію метану в атмосфері і зменшує його вплив на глобальне потепління. - Біологічне рециклювання: Мікроорганізми, які використовують газоподібні одновуглецеві субстрати, також грають важливу роль у біологічному рециклюванні. Вони розкладають органічні сполуки, які містять вуглець, на більш прості речовини, що можуть бути використані іншими організмами для росту і розвитку. Цей процес допомагає підтримувати баланс вуглецю в екосистемах і забезпечує доступність поживних речовин для інших організмів. В цілому, мікроорганізми, які використовують газоподібні одновуглецеві субстрати, відіграють важливу роль у біотехнології, екології та збереженні природних ресурсів. Їх здатність до використання газів як джерела енергії і вуглецю робить їх цінними інструментами для розв'язання проблем, пов'язаних зі збереженням енергії, очищенням середовища та сталим розвитком [6]. Тому глобальний попит на харчовий білок зростає в прогресії, як просте джерело одноклітинних білків з Methylococcus capsulatus (Bath), котрі можуть стати потенційною заміною рибного борошна та інших кормів для тварин. Покращення концентрації біомаси за допомогою статистичної оптимізації під час синергічної ферментації зі змішаним консорціумом трьох гетеротрофних бактерій Alcaligenes acidovorans, Aneurinibacillus danicus і Brevibacillus sp. може підвищити доцільність промислового процесу. Ці комбіновані стратегії призвели до збільшення біомаси на 265% з кінцевою концентрацією клітин 10,3 г/л, порівняно з 2,8 г/л при культивуванні з підживленням протягом 48 годин. Гетеротрофні бактерії не росли на даному середовищі або метані, але збільшували концентрацію біомаси при додаванні до культур M. capsulatus (Bath), очищали окислені побічні продукти природного газу, а також метаболічні побічні продукти облігатного метилотрофа, таким чином вносячи певну стабільність у загальний процес, максимізуючи швидкість росту та врожайність. Таким чином, важливо, щоб середовище для цього процесу було оптимізоване як змішана культура, оскільки присутність гетеротрофних бактерій має вирішальне значення для її промислового застосування [5]. Таблиця 2.2. Характеристика продуцента одноклітинного білку Methylococcus capsulatus за різних умов Біологічний агент Cклад поживного середовища: Концентр ація біомаси, г/л Тривалість культивування, год Особливості процесу біосинтезу Використана література Компоненти Methylococcus capsulatus (Bath) NCIMB 11132 з гетеротрофними бактеріями (ацетогеннами) Alcaligenes acidovorans, Aneurinibacillus danicus і Brevibacillus sp. Газова суміш CH4: Повітря: CO2 -9:9:2 MgSO4 × 7 H2O – 1; KNO3 - 1; CaCl2 × 2 H2O – 0,15; CuSO4 × 5 H2O – 2,5 ; Na2HPO4 × 12 H2O – 0,717; KH2PO4 – 0,272. 10,3 48 t = 32 °C pH=7,0 500 об/хв Enhanced Production of Single Cell Protein from M. capsulatus (Bath) Growing in Mixed Culture. [Електронний ресурс] // Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences 6(3):894. DOI:10.15414/jmbfs.2016/17.6 .3.894-899 http://dx.doi.org/10.15414/jmbfs.2016/17.6.3.894-899 http://dx.doi.org/10.15414/jmbfs.2016/17.6.3.894-899 Закінчення таблиці 2.2 Methylococcus capsulatus (Bath) NCIMB 11132 Газова суміш CH4: Повітря: CO2 -9:9:2 MgSO4 × 7 H2O – 1; KNO3 - 1; CaCl2 × 2 H2O – 0,15; Na2HPO4 × 12 H2O – 0,717; KH2PO4 – 0,272. 2,8 При періодичному культивуванні з підживленням протягом 48 годин. t = 32 °C pH=7,0 500 об/хв Enhanced Production of Single Cell Protein from M. capsulatus (Bath) Growing in Mixed Culture. [Електронний ресурс] // Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences 6(3):894. DOI:10.15414/jmbfs.2016/17.6 .3.894-899 http://dx.doi.org/10.15414/jmbfs.2016/17.6.3.894-899 http://dx.doi.org/10.15414/jmbfs.2016/17.6.3.894-899 Примітки: 1. FeNaEDTA (Етилендіамінтетраоцтова кислота, (HOOCCH?)?N(CH?)?N(CH?COOH)? - 0,05 мг/л; Na2EDTA* Ч 2 H2O –0,5 мг/л; FeSO4 Ч 7 H2O – 0,2 мг/л; H3BO3 – 0,03 мг/л; CoCl2 Ч 6H2O - 0,02 мг/л; 0,02; ZnSO4 Ч 7 H2O – 0,01 мг/л; MnCl2 Ч 4 H2O - 0,003 мг/л; NaMoO4 Ч 2 H2O -0,003 мг/л; NiCl2 Ч 6 H2O – 0,002 мг/л; 2. FeNaEDTA (Етилендіамінтетраоцтова кислота, (HOOCCH?)?N(CH?)?N(CH?COOH)? - 0,05 мг/л; Na2EDTA* Ч 2 H2O –0,5 мг/л; FeSO4 Ч 7 H2O – 0,2 мг/л; H3BO3 – 0,03 мг/л; CoCl2 Ч 6H2O - 0,02 мг/л; 0,02; ZnSO4 Ч 7 H2O – 0,01 мг/л; MnCl2 Ч 4 H2O - 0,003 мг/л; NaMoO4 Ч 2 H2O -0,003 мг/л; NiCl2 Ч 6 H2O – 0,002 мг/л; CuSO4 Ч 5 H2O – 0,25 мг/л. Висновок: Культивування штаму Methylococcus capsulatus (Bath) NCIMB 11132 з гетеротрофними бактеріями та Methylococcus capsulatus (Bath) NCIMB є найбільш презентативним з економічної точки зору. По-перше, час культивування даних штаму однаковий та становить 48 годин, По-друге, середовище для культивування також аналогічне. По-третє, перший продуцент має найнижчу продуктивність по біомасі, що є найважливішим параметром при масовому отриманні одноклітинних білків. З урахуванням цих факторів, можна стверджувати, що Methylococcus capsulatus (Bath) NCIMB 11132 з гетеротрофними бактеріями є найменш вигідним варіантом для планованого виробництва білка одноклітинних організмів. Таблиця 2.3 Вартість поживних середовищ для культивування продуцентів одноклітинного білку Примітка. * - Ціни наведено станом на червень 2023 р. 1. Посилання Продуцент Компонент поживного середовища, г/л Ціна компонента, грн/кг Вартість компонента (грн) на 1 л/ об'єму середовища Джерело інформації (1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10,11 12,13,)* Methylococcus capsulatus (Bath) NCIMB 11132 з гетеротрофними бактеріями (ацетогеннами) Alcaligenes acidovorans, Aneurinibacillus danicus і Brevibacillus sp. CH4: Повітря: CO2 - 9:9:2 н/п н/п н/п MgSO4 × 7 H2O – 1 28 0,028 1 KNO3 - 1 116 0,116 2 CaCl2 × 2 H2O – 0,15 60 0,009 3 CuSO4 × 5 H2O – 2,5 200 0,5 4 Na2HPO4 × 12 H2O – 0,717 42 0,03 5 KH2PO4 – 0,272 101 0,028 6 Вартість 1 л/об'єму середовища – 0,71 Methylococcus capsulatus (Bath) NCIMB 11132 CH4: Повітря: CO2 - 9:9:2 н/п н/п н/п MgSO4 × 7 H2O – 1 116 0,028 2 KNO3 - 1 60 0,116 3 CaCl2 × 2 H2O – 0,15 200 0,009 4 CuSO4 × 5 H2O – 2,5 42 0,5 5 Na2HPO4 × 12 H2O – 0,717 101 0,03 6 KH2PO4 – 0,272 116 0,028 2 Вартість 1 л/об'єму середовища –0,71 https://ukragrotop.com.ua/ua/p1747704866-sulfat-magniya-mgo.html?source=merchant_center&gclid=Cj0KCQjw7PCjBhDwARIsANo7CgnBAdlHWcg7x9TrVeU6jkfkVsTQjqLGcgSqjiz_jNZVY5ahGsogB2kaAlR3EALw_wcB https://snabhim.com.ua/selitra_kalievaya?gclid=Cj0KCQjw7PCjBhDwARIsANo7Cgk6G3g15mAGHSNmfTF2V-CcHdycqnVWR-RawxFqosRXMSIcGn3doeEaAknQEALw_wcB https://silur.prom.ua/ua/p5226926-kaltsij-hloristyj.html https://silur.prom.ua/ua/p5216518-med-sernokislaya-vod.html https://flagma.ua/natriy-fosfornokisly-2-zameshchenny-bv-pishch-o13134866.html https://megachem.com.ua/kalij-fosfornokislyj-tehnicheskij.html https://snabhim.com.ua/selitra_kalievaya?gclid=Cj0KCQjw7PCjBhDwARIsANo7Cgk6G3g15mAGHSNmfTF2V-CcHdycqnVWR-RawxFqosRXMSIcGn3doeEaAknQEALw_wcB https://silur.prom.ua/ua/p5226926-kaltsij-hloristyj.html https://silur.prom.ua/ua/p5216518-med-sernokislaya-vod.html https://flagma.ua/natriy-fosfornokisly-2-zameshchenny-bv-pishch-o13134866.html https://megachem.com.ua/kalij-fosfornokislyj-tehnicheskij.html https://snabhim.com.ua/selitra_kalievaya?gclid=Cj0KCQjw7PCjBhDwARIsANo7Cgk6G3g15mAGHSNmfTF2V-CcHdycqnVWR-RawxFqosRXMSIcGn3doeEaAknQEALw_wcB Висновок: Оскільки компоненти поживного середовища аналогічні, а також С (Карбон) та N (Нітроген) подаються в надлишку з періодичним оновленням, тому дацільність порівнюванння на даному етапі залишається схожоою до попередньої таблиці (2.1) Таблиця 2.4 Умовна вартість 1 г одноклітинного білка на подібних субстратах Висновок: Ураховуючи дані з попередніх таблиць можна стверджувати, що доцільніше використовувати Methylococcus capsulatus (Bath) NCIMB 11132 з гетеротрофними бактеріями, оскільки даний продуцент має більші показники концентрації біомаси та меншу умовну вартість за 1 г цільового продукту [5] . Біологічний агент Концентрація біомаси, г/л Тривалість культивування, год Кількість утвореної біомаси за годину, г/год Вартість середовища, грн/л Умовна вартість 1 г цільового продукту, грн/г Methylococcus capsulatus (Bath) NCIMB 11132 з гетеротрофними бактеріями (ацетогеннами) Alcaligenes acidovorans, Aneurinibacillus danicus і Brevibacillus sp. 10,3 48 0,22 0,71 0,069 Methylococcus capsulatus (Bath) NCIMB 11132 2,8 48 0,06 0,71 0,25 2.3 Морфолого-культуральні та фізіолого-біохімічні ознаки біологічного агента Methylococcus capsulatus було виділено з гарячого джерела. Це грамнегативні коки, нерухомі. Не утворюють спор. Облігатний метанотроф. Клітини містять стопки везикулярних дисків, що є типовим розташуванням внутрішньоцитоплазматичної мембрани в метанотрофах типу I [16]. Рис. 2.1 та 2.2. Methylococcus capsulatus у світловому мікроскопі при збільшенні ×90. 2.2. Фізіолого-біохімічні ознаки По відношенню до кисню Methylococcus capsulatus є облігатним аеробом, але може рости в умовах, в яких мало доступного молекулярного кисню. По відношенню до температури – термофіл, здатний до росту при температурах від 15 до 48°C (оптимум 30–45°C). Росте в середовищах, при значеннях рН між рН 5,5 і 8,5. Оптимум рН 6,5– 7,0 - нейтрофіл. За типом живлення Methylococcus capsulatus є хемоорганогетеротрофом, метанотрофом типу I. Метанотрофи — мікроорганізми, що можуть використовувати газ метан як єдине джерело вуглецю і енергії. Вони вимагають одно-вуглецевих сполук і кисню для виживання, комбінуючи обидва для синтезу формальдегіду, який потім використовується для отримання органічних сполук. Окрім метану, M. capsulatus здатний окислювати деякі органічні водневі сполуки, такі як метанол. Є фіксаторами атмосферного азоту та облігатними утилізаторами сполук С1 для фіксації енергії та вуглецю [17]. 2.4.Таксономічний статус біологічного агенту Бактерії класифікують за способами їх за морфолого-культуральними( форма клітини, наявність джгутиків, рухливість утворення спор) та фізіолого-біохімічним ознаками( синтез певних ферментів споживання певних субстратів, джерел біогенних елементів) а також за генетичними ознаками найменш змінених генів. Класифікація бактерій є більш консервативною ніж у грибів, оскільки мало разів змінювалася Єдина класифікація бактерій наведена у «Визначнику Берги», більш пізні видання –основана на морфолого- культуральних та фізіолого-біохімічних ознаках , більш пізні видання на цих та на філогенетичних ознаках( підходах) Перша комплексна класифікація базувалися лише на морфолого- фізіологічних бактерій і була викладена у першому виданні Визначника бактерій Берги у 1923р , наступні видання враховували й належність видів до певних місць існування та їх адаптацію до цих умов заносили стосовно нових відкритих мікроорганізмів за вищезазначеним підходом до 1986 р до 9 видання визначника Бергі.[18]. Філогенетична класифікація бактерій Берги, що спиралася на морфолого- культуральні та фізіолого-біохімічні ознаки Сучасна (філогенетична) класифікація для Methylococcus capsulatus : [19]. Домен – Bacteria Тип – Proteobacteria Клас – Gammaproteobacteria Порядок – Methylococcales Родина – Methylococcaceae Рід – Methylococcus Повний геном M. capsulatus (Bath) складається з 3 304 561 пар основ з 63,6% вмістом Г-Ц. Загальна кількість CDS (передбачувана кодуюча послідовність) становить 3120 із середнім розміром 962 пари основ. Кількість оперонів рРНК (16S-23S-5S) у геномі M. capsulatus (Bath) становить 2, кількість генів тРНК — 46, а кількість генів sRNA — 3. 1766 білків відомої функції та ролі та 109 білків з відомою функцією, але невідомою рольовою категорією, було виявлено, що виконує функції, подібні до M. capsulatus (Bath) [19]. Рис. 2.3. Геном Methylococcus capsulatus. РОЗДІЛ 3. ТЕХНІКО-ЕКОНОМІЧНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ 3.1. Потреба у цільовому продукті Однією з найбільших екологічних проблем промислових ферм є утворення великої кількості гною або посліду. В Україні наразі немає жорстких вимог до того, як ферми будуть утилізувати відходи. Гній або послід може накопичуватися та зберігатися у спеціальних сховищах (з можливим подальшим компостуванням, або вельмикультивуванням частини фракції при розділенні на фракції), піддаватися анаеробній біологічній обробці для одержання біогазу, фізико-хімічній або механіко-біологічній обробці [20]. Сучасним підходом у боротьбі із надмірністю промислових відходів є їх переробка у біогаз – газ, утворюваний за допомогою бактерій, склад якого схожий на природний газ: до 98% метану разом із сірководнем, вуглекислим газом, водою тощо. Таким чином розкладання біомаси (відходів) відбувається під впливом трьох основних видів бактерій: гідролітичних, кислотоутворюючих і метаноокиснювальних [21]. Сировиною-брагою для нього можуть бути технічні культури (ріпак, верба), гній тварин, будь-який жом – буряковий, ягідний, овочевий, а також солома або очерет [22]. Біогаз має ряд переваг перед природним газу, а саме:  виготовляється з біологічної сировини, тому його виробництво та спалювання є етапами природного кругообігу вуглецю, який не призводить до накопичення природного газу в атмосфері та парниковий ефект; Змн Лист № докум. Підпис Дата Арк. 27 НУХТ БТЕК 04.01.34 КР ПЗ Розроб. Олексієнко Красінько Керівник Рецензент Н.контр. Затверд. Стабніков В.П. ТЕХНІКО-ЕКОНОМІЧНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ .Літ. Аркушів 108 Кафедра БТМ  природний газ видобувається з надр землі і не є компонентом атмосфери, тому її горіння призводить до накопичення вуглекислого газу [23]. Створення енергогенерації, що працює на біогазі, – доволі новий напрям для України. До 2012 року в країні було лише сім біогазових комплексів, встановлених на полігонах твердих побутових відходів. Проте, у 2013 році перші біогазові комплекси почали вводити в експлуатацію й сільського підприємства [24]. Відкриття першої черги біогазового комплексу на території Теофіпольського цукрового заводу в Хмельницькій області відбулося у грудні 2017 року. Другу чергу ввели в експлуатацію у червні 2018 року, вона працювала в тестовому режимі й ось нарешті вийшла на проектну потужність – 15,6 МВт. Відкриття біогазової установки позитивно вплинуло на соціально- економічний розвиток району. Завдяки реалізації таких проектів сьогодні район посідає 2-ге місце у Хмельницькій області. Наразі це – перша в Україні й найбільша у світі станція з виробництва біогазу, яка працює за технологією високонавантажених реакторів [25]. Зброджування гною або посліду дасть змогу частково вирішити проблеми з відходами тваринництва, а саме зменшити ризик забрудення ґрунтів та води, зменшити викиди в атмосферу та вплив на зміни клімату. Біогаз, отриманий зброджуванням відходів тваринництва, може використовуватися для виробництва електроенергії та тепла, замінювати викопні енергоносії, такі, як вугілля, природний газ і нафта, використання яких спричиняє велику кількість парникових викидів [26]. Біогаз також можна розглядати як економічний субстрат для культивування метанотрофних мікроорганізмів, зокрема для одержання мікробного білка. У проектованому нами виробництві основна маса утвореного біогазу в обраному тваринницькому комплексі буде використовуватися для енергетичних потреб самого господарства і лише невелика, а саме близько 0,1% – на потреби культивування. 3.2. Обрахунок річної потужності виробництва білка одноклітинних організмів У табл. 3.1 представлено узагальнену інформацію щодо біогазових установок, працюючих на території України, зокрема біля відомих тваринницьких комплексів [27]. Таблиця 3.1 Робочі біогазові установки в Україні Підприємст во Рік запус ку Погол ів’я Види сировин и Об’єм сирови ни, т/добу Встановл ена електрич на потужніст ь, кВте Постачаль ник технології Свиноферма комбінату «Запоріжста ль», м. Запоріжжя 1993 8000- 12000 Гній свиней 20-22 – Bigadan Ltd, Данія Свиноферма корпорації «Агро- Овен», с. Оленівка, Дніпропетр. обл. 2003 15000 Гній свиней, жирові відходи забою птиці 80 180 BTG, Нідерланди С/г компанія «Еліта», с. Терезине, Київська обл. 2009 1000 Гній ВРХ та свиней (90:10 за СР) 60 250 LIPP, Німеччина Закінчення таблиці 3.1 Ферма ВРХ «УМК», с. В.Крупіль, Київська обл. 2009 4000+ 2000 Гній ВРХ 400 625+330 Зорг, Україна Птахофабри ка МХП «ОрільЛідер », с. Єлізаветовка , Дніпропетр. обл. 2012 – Послід та силос 140 посліду та 80 силосу 5000 NVT, Нідерланди Свинокомпл екс Даноша, с. Копанки, ІваноФранкі вська обл. 2013 – Гній свиней та відходи с/г 4000 1000 – Як видно із даних табл. 1.1, переважна частина тваринницьких комплексів забезпечена біогазовими установками саме імпортного походження, лише ферма «УМК» користується послугами українського постачальника. Зважаючи на цю інформацію, можемо запропонувати сільсько-господарській компанії «Еліта» Київської області впровадити технологію окиснення метану та вуглекислого газу, що утворюються при переробці відходів у метантенку, у білок одноклітинних організмів за використання M. capsulatus NCIMB 11132. Відомо, що при переробці 1 т сировини (відходів тваринницького комплексу) утворюється 350-400 м 3 біогазу [28]. Основний компонент біогазу – метан – складає близько 70 % [9] від встановленого об’єму, тобто 245 – 280 м 3 . Отже, із 60 т на добу відходів (господарства «Еліта) утвориться 14 700 м 3 (на рік 5 365 500 м 3 ) метану. Велику частину такого об’єму метану можна використати з метою поповнення саме енергетичних потреб самого підприємства, а частину – для виробництва білка одноклітинних організмів змішаною культурою. За використання M. capsulatus (Bath) NCIMB 11132 з гетеротрофними бактеріями (ацетогеннами) Alcaligenes acidovorans, Aneurinibacillus danicus і Brevibacillus sp. можна синтезувати білок, що накопичується у біомасі концентрацією 10,3 г/л [29]. За даними статті [10] із 9 частин метану можна одержати 10,3 г/л біомаси, тому із 1 частини буде 1,14 г/л. Пропонуємо, що із 5000 м 3 утворюваного метану за рік можна отримати таку кількість культурального середовища: 5000 · 1,14 = 5700 л Слід врахувати, що неминучим є утворення втрат при виділенні такого білку, що складають 30 %. Тому кількість культурального середовища становитиме: 5700 · 1,3 = 7410 л 3.3. Розрахунок необхідної кількості циклів для виробництва білку і геометричного об’єму газового біореактору Обрахуємо, який об’єм культурального середовища потрібно отримати за цикл біосинтезу, аби у подальшому розрахувати кількість стадій підготовки посівного матеріалу. Обираємо, що виробництво буде працювати протягом 130 трудоднів, тоді об’єм культурального середовища за добу складатиме: Vд = Vгп / Ттр = 7410 / 130 = 57 л Кількість культурального середовища за цикл буде становити: Vцк = (К1 · Vд · Тцф)/24 = (1,2 · 57 · 56) / 24 = 159,6 л/цикл, де Tцф – цикл роботи ферментера, який включає в себе тривалість виробничого біосинтезу (48 год) та час підготовки ферментера до роботи (8 год). К1 – коефіцієнт запасу, що враховує можливість нестерильних операцій (К1 = 1,1 – 1,5). Підготовка ферментера включає: миття та огляд (1,5 год), перевірка на герметичність (0,5 год), підігрів апарату (0,5 год), стерилізація (1 год), охолодження (1 год), завантаження середовища (2 год), засів (0,5 год), вивантаження культурального середовища (1 год). Визначивши об’єм КС за один цикл і знаючи коефіцієнт заповнення Кз, визначаємо геометричний об’єм ферментера: Vг = Vцк / Кз = 159,6/0,5 = 319,2 л. Зважаючи на дані щодо розмірів стандартних ферментерів, найближчим за геометричним об’ємом є газовий біореактор Vф = 300 л. Наступним кроком уточнюємо коефіцієнт заповнення: Кз = 146,3/300 = 0,53 – значення задовольняє діапазон, встановлений для аеробних мікроорганізмів . 3.4. Розрахунок потрібної кількості стадій підготовки посівного матеріалу Як попередньо зазначалося, за один виробничий цикл отримують 159,6 л культурального середовища. При отриманні культурального середовища слід враховувати втрати цього середовища через колектор відпрацьованого повітря, які становлять від 10 до 15 відсотків. Отже, кількість поживного середовища та посівного матеріалу перед виробничим біосинтезом становитиме: Vроб.1 = Vкр/(1-Еф) = 159,6/0,9 = 177,3 л, де Еф – рідини під час біосинтезу. Отже, робочий об’єм ферментера перед біосинтезом дорівнює 177,3 л. За попередньо обраного коефіцієнта заповнення 0,5 геометричний об’єм ферментера складатиме: Vф = 177,3/0,5 = 354,6 л. Приймаємо найближчий за об’ємом стандартний ферментер Vсф = 300 л. Уточнюємо коефіцієнт заповнення: Кз1 = 177,3/300 = 0,59. Кількість посівного матеріалу (доза) становить 35 % від об’єму поживного середовища, оскільки частка M. capsulatus складає 10 %, а A. acidovaorans становить 10% і по 7,5% Brevibacillus sp. і A. danicus [7]. Тоді об’єм поживного середовища для біосинтезу у виробничому ферментері буде становити: Vпс1 = Vроб.1/(1+Хф) = 177,3/(1+0,35) = 131,3 л, де Xф = 0,35 – доза посівного матеріалу для ферментера. Тому кількість посівного матеріалу становить: Vпм1 = Vроб.1 – Vпс1 = 177,3 – 131,3 = 46 л. Також слід передбачити, що під час одержання 46 л інокуляту в посівному апараті 10 % культурального середовища буде втрачено внаслідок краплевиносу через колектор відпрацьованого повітря. Тому об’єм поживного середовища та посівного матеріалу в посівному апараті становитиме: Vроб.2 = Vпм1/(1-Епа) = 46/0,9 = 51,1 л. Обрахований об’єм інокуляту 51,1 л за коефіцієнта заповнення 0,5 можна одержати в посівному апараті об’ємом: Vпа2 = 51,1/0,5 = 102,2 л. Приймаємо найближчий за об’ємом стандартний посівний апарат Vс.па1 = 100 л. Уточнюємо коефіцієнт заповнення: Кз.2 = 51,1/100 = 0,51. Кількість посівного матеріалу для посівного апарата становить 35% від об’єму поживного середовища. Тоді об’єм поживного середовища для одержання інокуляту у посівному апараті буде становити: Vпс2 = Vроб.2/(1+Хпа) = 51,1/(1+0,35) = 37,8 л, де Xф = 0,35 – доза посівного матеріалу для посівного апарата. Звідси випливає, що кількість посівного матеріалу: Vпм2 = Vроб.2 – Vпс2 = 51,1 – 37,8 = 13,3 л. З урахуванням втрат 10% культурального середовища через колектор відпрацьованого повітря, об'єми поживного середовища та посівного матеріалу в посівному апараті будуть наступними: Vроб.3 = Vпм2/0,9 = 13,3/0,9 = 14,78 л. Об’єм інокуляту 13,3 л за коефіцієнта заповнення 0,5 можна отримати в інокуляторі об’ємом: Vін1 = 13,3/0,6 = 26,6 л. Обираємо найближчий за об’ємом стандартний інокулятор Vс.ін1 = 30 л. Уточнюємо коефіцієнт заповнення: Кз.3 = 14,78/30 = 0,5. Кількість посівного матеріалу становить 35 % від об’єму поживного середовища. Тоді об’єм поживного середовища в інокуляторі буде складати: Vпс3 = Vроб.3/(1+Хін) = 14,78/(1+0,35) = 10,95 л, де Xін = 0,35 – доза посівного матеріалу для інокулятора. Звідси кількість посівного матеріалу: Vпм3 = Vроб.3 – Vпс3 = 14,78 – 10,95 = 3,83 л. З урахуванням того, що під час одержання 3,83 л посівного матеріалу в інокуляторі 10 % культурального середовища буде втрачено через колектор відпрацьованого повітря. Тоді об’єм поживного середовища та посівного матеріалу в інокуляторі становитиме: Vроб.4 = Vпм3/0,9 = 3,83/0,9 = 4,26 л. Об’єм інокуляту 4,26 л за коефіцієнта заповнення 0,5 можна отримати в інокуляторі об’ємом: Vін2 = 4,26/0,5 = 8,52 л. Приймаємо найближчий за об’ємом стандартний інокулятор Vс.ін2 = 10 л. Уточнюємо коефіцієнт заповнення: Кз.4 = 4,26/10 = 0,43. На посівний матеріал припадає 35 % від об’єму поживного середовища. Тоді об’єм поживного середовища в посівному апараті буде становити: Vпс4 = Vроб.4/(1+Хін) = 4,26 /(1+0,35) = 3,15 л, де Xін = 0,35 – встановлена доза посівного матеріалу для інокулятора. Звідси кількість посівного матеріалу: Vпм4 = Vроб.4 – Vпс4 = 4,26 – 3,15 = 1,11 л. Для одержання посівного матеріалу Vпм4 = 1,11 л для засіву малого інокулятора можна культивуванням бактерій у колбах на качалці. Для цього обираємо качалочні колби об’ємом Vколб = 750 мл з коефіцієнтом заповнення Кзк = 0,2. Тоді кількість колб становить: Nколб = Vпм4/( Vколб*Кзк) = 1110/(750*0,2) = 7,4 ≈ 8 колб Отже, за результатами розрахунків для біосинтезу мікробного білку бактеріальним консорціумом M. capsulatus (Bath) NCIMB 11132 з гетеротрофними бактеріями (ацетогеннами) A. acidovorans, A. danicus і Brevibacillus sp. необхідно встановити газовий біоректор для біосинтезу об’ємом 300 л, посівний апарат об’ємом 100 л, інокулятори по 30 та 10 л та підготувати 8 качалочних колб. РОЗДІЛ 4. БІОСИНТЕЗ ЦІЛЬОВОГО ПРОДУКТУ Катаболізм ростового субстрату у Methylococcus capsulatus Methylococcus capsulatus здатні використовувати метан як єдине джерело вуглецю і енергії. Під час росту на метані відновлювальні еквіваленти для дихального ланцюга можуть бути отримані тільки окисненням метану CH4 до CO2, оскільки в цих умовах не утворюється ацетил-КоА, необхідний для окиснення в ЦТК. Анаболічний (конструктивний) метаболізм метанотрофів розходиться з енергетичним метаболізмом на рівні формальдегіду. В аеробних умовах метанотрофи об'єднують кисень і метан з утворенням формальдегіду , який потім включається в органічні сполуки через сериновий шлях або шлях рибулози монофосфату (RuMP) і вуглекислий газ, який вивільняється. Метанотрофи типу I є частиною Gammaproteobacteria і використовують шлях RuMP для асиміляції вуглецю [19]. Рибулозомонофосфатний цикл. Інша назва цього циклу гексулозофосфатний цикл. Основними реакціями циклу є конденсація рибулозо-5-фосфату та формальдегіду під дією ключового ферменту гексулозофосфатсинтази і ізомеризація продукту реакції у фруктозо-6-фосфат. Акцептор (рибулозо-5- фосфат) регенерується під дією ферментів транкетолази та трансальдолази. У результаті функціонування циклу три молекули формальдегіду перетворюються в молекулу диоксиацетонфосфату, який може використовуватись для конструктивного метаболізму. Змн Лист № докум. Підпис Дата Арк. 34 НУХТ БТЕК 04.01.34 КР ПЗ Розроб. Олексієнко Красінько Керівник Рецензент Н.контр. Затверд. Стабніков В.П. БІОСИНТЕЗ ЦІЛЬОВОГО ПРОДУКТУ .Літ. Аркушів 108 Кафедра БТМ Суттєвою особливістю метаболізму метанокислюючих бактерій з гексулозофосфатним шляхом є дефект у циклі Кребса – відсутність 2- оксоглутаратдегідрогенази. У зв’язку з цим цикл Кребса відіграє винятково біосинтетичну роль, а анаплеротичною реакцією, в якій синтезуються С4 дикарбонові кислоти, є карбоксилювання фосфоенолпірувату. Вуглеводи синтезуються шляхом глюконеогенезу [30]. Рис. 4.1. Перетворення метану в формальдегід і рибулозомонофосфатний цикл фіксації формальдегіду Метанотрофи унікальні тим, що володіють метан-монооксигеназами (ММО), які каталізують перший етап окислення метану. Відомо, що M. capsulatus генерує мембранно-зв’язану форму, pMMO, і розчинну форму, sMMO, і ці два ферменти були добре вивчені, оскільки їхня здатність здійснювати окислення метанy. Methylococcus capsulatus (Bath) здатний експресувати два різних типи метан-монооксигеназ: розчинну форму метан-монооксигенази (sMMO) і дисперсну або мембранно-зв’язану форму (pMMO). На експресію цих ферментів сильно впливає позаклітинна концентрація міді; коли M. capsulatus (Bath) вирощують у присутності низьких рівнів міді, sMMO є активним, тоді як pMMO є переважно активним при високих рівнях. Обидва ферменти потребують зовнішнього донора електронів, щоб розірвати зв’язок C-H у метані. Хоча донором електронів для sMMO є NADH, нативний відновник для pMMO ще не з’ясований через труднощі з очищенням ферменту. і перевірити його активність in vitro. Рис. 4.4. Метаболізм метану Methylococcus capsulatus [19 ,30]. РОЗДІЛ 5. ОБҐРУНТУВАННЯ ВИБОРУ ТЕХНОЛОГІЧНОЇ СХЕМИ 5.1. Вибір умов і способу культивування Культивування мікроорганізмів у газовому біореакторі з надлишком карбоно- та нітрогеномісного середовища є ефективним методом виробництва біологічних продуктів. Основною особливістю цього процесу є контрольоване оточення, в якому мікроорганізми ростуть і розмножуються. Особливості культивування мікроорганізмів у газовому біореакторі включають наступне: - Регульовані умови: Газові біореактори забезпечують можливість контролювати температуру, рівень кисню, pH-середовище, концентрацію поживних речовин та інші фактори, які впливають на ріст та метаболізм мікроорганізмів. Це дозволяє оптимізувати умови для максимального виробництва бажаного продукту. - Висока масштабованість: Газові біореактори можуть мати різний об'єм, починаючи від кількох літрів і до десятків кубометрів. Це дає можливість масштабувати процес виробництва в залежності від потреб. Великі біореактори часто використовуються в промисловому масштабі для виробництва комерційних біологічних продуктів. - Аеробні та анаеробні процеси: Газові біореактори можуть бути налаштовані як для аеробних (з киснем) так і для анаеробних (без кисню) процесів. Це дозволяє вирощувати широкий спектр мікроорганізмів, які потребують різних умов для свого росту та метаболізму [31]. Отже, особливості культивування мікроорганізмів у газовому біореакторі можна розглядати з кількох аспектів: Змн Лист № докум. Підпис Дата Арк. 38 НУХТ БТЕК 04.01.34 КР ПЗ Розроб. Олексієнко Красіньок Керівник Рецензент Н.контр. Затверд. Стабніков В.П. ОБҐРУНТУВАННЯ ВИБОРУ ТЕХНОЛОГІЧНОЇ СХЕМИ .Літ. Аркушів 108 Кафедра БТМ Контрольоване середовище: Газові біореактори забезпечують можливість створювати та підтримувати оптимальні умови для росту і розмноження мікроорганізмів. Різні параметри, такі як температура, pH-середовище, концентрація кисню або інших газів, тиск, а також концентрація поживних речовин, можуть бути точно контрольовані та налаштовані для задоволення потреб культур. - Масштабованість: Газові біореактори можуть мати різний об'єм, від невеликих лабораторних масштабів до великих промислових систем. Масштабованість є важливою особливістю, оскільки дозволяє збільшувати обсяг виробництва в залежності від потреб. Великі біореактори використовуються в промисловості для виробництва різноманітних біологічних продуктів, таких як ферменти, біологічно активні речовини, антитіла тощо. - Режими аерації: Газові біореактори можуть бути налаштовані для проведення як аеробних, так і анаеробних процесів. У аеробних умовах мікроорганізми використовують кисень для свого росту та метаболізму, тоді як у анаеробних умовах вони працюють без доступу до кисню. Це дозволяє культивувати широкий спектр мікроорганізмів, включаючи ті, що здатні до ферментації та інших анаеробних процесів. - Використання носія: У газовому біореакторі мікроорганізми часто ростуть на носію або матеріалі, який надає їм опору та поверхню для прикріплення. Цей носій може бути наприклад пластиковими матеріалами, сіткою, губкою або пластинами. Використання носія дозволяє збільшити поверхню доступу для росту мікроорганізмів, що забезпечує більшу густину мікробної суспензії в біореакторі і збільшує продуктивність процесу. Наприклад, у виробництві бактеріальних біоплівок, підкладка допомагає стабілізувати ріст бактерій і забезпечує їх ефективну функціональність [32]. - Контроль незапланованих реакцій: Газові біореактори дозволяють здійснювати контроль над незапланованими реакціями та уникати небажаних процесів. Наприклад, в процесах ферментації може відбуватися непередбачуване нагрівання через виділення тепла. У газовому біореакторі можуть бути встановлені системи охолодження або контрольованого введення холодного газу для підтримки оптимальної температури. - Керованість та автоматизація: Газові біореактори можуть бути повністю автоматизованими та керованими за допомогою комп'ютерних систем. Це дозволяє точно контролювати всі параметри процесу, від дозування поживних речовин до моніторингу росту мікроорганізмів. Керованість та автоматизація забезпечують стабільність та ефективність виробництва. - Енергоефективність: Газові біореактори можуть бути більш енергоефективними порівняно з іншими методами культивування мікроорганізмів, такими як ферментери або планшетні культури. Це пов'язано з можливістю контролювати аерацію, використання ефективних систем змішування та оптимізації енергетичних процесів в біореакторі. Енергоефективність допомагає знижувати витрати на енергію та екологічний вплив процесу. - Гнучкість та адаптивність: Газові біореактори є гнучкими та адаптивними до різних типів мікроорганізмів та процесів. Вони можуть бути налаштовані для різних видів культур, включаючи бактерії, гриби, дріжджі та водорості. Крім того, газові біореактори можуть бути використані для різних типів процесів, таких як виробництво ферментів, біологічно активних речовин, біопалива або водню. Це дає можливість адаптувати процес до конкретних потреб та вимог [27]. Methylococcus capsulatus - це метанотрофний бактеріальний вид, який володіє здатністю окислювати метан для свого росту та метаболізму. Вирощування Methylococcus capsulatus у газовому біореакторі може мати деякі особливості, які варто враховувати: - Постачання метану: Methylococcus capsulatus є метанотрофом, тому для його культивування важливо забезпечити постійне постачання метану в біореактор. Це може здійснюватися шляхом забезпечення відповідних умов газообміну у біореакторі, таких як аерація або нагнітання газу. - Наявність кисню: Methylococcus capsulatus є мезофільними організмами, що означає, що вони вимагають наявності кисню для свого росту. Газовий біореактор повинен бути налаштований таким чином, щоб забезпечити достатнє аерацію та достатню концентрацію кисню для Methylococcus capsulatus. - Регулювання pH: pH-рівень середовища також має значення для культивування Methylococcus capsulatus. Зазвичай оптимальний pH для цього виду лежить в діапазоні 6,5-7,5. Газовий біореактор має бути здатним контролювати та підтримувати потрібний pH-рівень шляхом додавання лужних або кислих розчинів. - Поживні речовини: Для ефективного росту Methylococcus capsulatus необхідні поживні речовини, такі як мінеральні солі та вуглеводи. Газовий біореактор повинен забезпечити наявність необхідних поживних речовин шляхом додавання відповідних розчинів або субстратів. - Температура: Methylococcus capsulatus має оптимальний діапазон температур для свого росту, який зазвичай коливається від 25 до 40 градусів Цельсія. Газовий біореактор повинен бути здатним підтримувати стабільну температуру в межах цього діапазону шляхом використання системи регулювання та контролю температури. - Система змішування: Забезпечення ефективного змішування реакційної суміші є важливим аспектом культивування Methylococcus capsulatus у газовому біореакторі. Це допомагає забезпечити розподіл метану та кисню, поживних речовин і забезпечити однорідність умов для росту мікроорганізмів. Газовий біореактор може мати механічні системи змішування, такі як пропелери або ротори, або використовувати повітряні струмені або газову аерацію для забезпечення змішування. - Моніторинг та контроль: У газовому біореакторі важливо мати систему моніторингу та контролю параметрів, таких як рівень кисню, pH, температура та інші, для підтримки оптимальних умов для росту Methylococcus capsulatus. Це може включати в себе використання датчиків та автоматичних регуляторів, які дозволяють стежити за параметрами та виконувати необхідні корекції [28]. - Стерильність: Забезпечення стерильних умов є важливим аспектом вирощування Methylococcus capsulatus у газовому біореакторі. Це допомагає запобігати контамінації культури небажаними мікроорганізмами та забезпечує чистоту процесу. Газовий біореактор повинен бути конструйований та обладнаний таким чином, щоб забезпечити стерильність. Це може включати в себе використання автоклавування для стерилізації реактору та всіх використовуваних пристроїв та матеріалів перед початком культивування. Крім того, можуть використовуватися фільтри для газу та рідини, що входять і виходять з біореактора, щоб запобігти потенційній контамінації. - Моніторинг росту: Важливо проводити моніторинг росту Methylococcus capsulatus у газовому біореакторі для визначення його фізіологічних параметрів та оцінки продуктивності. Це може включати в себе вимірювання концентрації бактерій, споживання метану, вироблення біомаси або виробництва біопродуктів. Методи моніторингу можуть варіюватися в залежності від конкретних цілей і вимог дослідження. - Оптимізація параметрів: В процесі вирощування Methylococcus capsulatus у газовому біореакторі може виникати необхідність оптимізувати різні параметри, такі як рівень кисню, pH, температура, постачання поживних речовин та інші. Це може включати настройку режимів аерації, регулювання pH за допомогою буферів або кислот, оптимізацію температурного режиму та інші корекції [6-8]. 5.2. Вибір типу газового ферментера. Газові ферментери, також відомі як газові біореактори, є контейнерами або системами, які використовуються для культивування мікроорганізмів або клітин у присутності газової фази. Існують різні типи газових ферментерів, які можуть варіюватися за конструкцією, формою та способом подачі газів. Деякі типи газових ферментерів включають: - Потокові реактори: Це тип газового ферментера, де культура переміщується через реактор за допомогою потоку газу або рідини. Вони можуть бути вертикальними або горизонтальними, а гази і рідини можуть бути змішані з використанням пропелерів або інших змішувальних пристроїв. - Шарові ферментери: Це тип газового ферментера, який має форму сфери або циліндра з нижнім входом газу та верхнім виходом газу. Вони можуть мати систему змішування, таку як пропелери або спеціальні системи змішування для забезпечення рівномірного розподілу газу. - Пузирчасті ферментери: Цей тип газового ферментера використовує подачу газу у вигляді пузирів через нижнє дно ферментера. Пузирчасті струмені газу забезпечують змішування та доставку газу до культури, що сприяє ефективному обміну газів. - Мембранні ферментери: Це тип газового ферментера, який використовує мембрану або полімерний матеріал для забезпечення контрольованої передачі газу у культуру. Гази можуть проникати через мембрану, забезпечуючи поступове вивільнення газу у культурі. - Гель-ферментери: Цей тип газового ферментера використовує гельову матрицю як носій для культури. Гель може бути наповнений газом, або газ може бути постачаний через пористу структуру гелю. Газ проникає через гель і забезпечує рівномірне поширення газу по всьому об'єму гелю, сприяючи змішуванню та обміну газів з культурою. - Вертикальні ферментери: Це тип газового ферментера, який має вертикальну орієнтацію. Вони зазвичай мають конічну форму з нижнім входом газу і верхнім виходом газу. Вертикальні ферментери можуть бути оснащені системами змішування, такими як пропелери або ротори, для забезпечення рівномірного розподілу газу та змішування культури. - Модульні ферментери: Це тип газового ферментера, який складається з модульних блоків або реакторних одиниць, які можуть бути з'єднані для збільшення об'єму реактора або легко розбираються для очищення та обслуговування. Це дозволяє гнучко контролювати розмір та об'єм ферментера залежно від потреб. - Біосорбційні ферментери: Цей тип газового ферментера використовує спеціальні матеріали, відомі як біосорбенти, для поглинання та утримання газу. Біосорбенти можуть бути вбудовані в реактор або мати форму зерен або часток, які розміщуються в реакторі. Газ проходить через біосорбент, де відбувається його взаємодія з мікроорганізмами або клітинами, що забезпечує обмін газів [28, 29]. Ці типи газових ферментерів представляють лише деякі з можливих варіацій. В реальності існує багато інших типів газових ферментерів, які можуть бути використані в залежності від конкретних потреб та дослідницьких цілей. Наприклад: - Фіксовані фільми: Це тип газового ферментера, де культура росте на поверхні фіксованого матеріалу, такого як сітка, керамічні частки або пластикові модулі. Газ пропускається через матеріал, і мікроорганізми або клітини прикріплюються до поверхні, забезпечуючи реакцію з газовою фазою. - Мініатюрні ферментери: Це компактні ферментери, які мають невеликий об'єм, часто в мілілітровому або мікролітровому діапазоні. Вони використовуються для високопродуктивних досліджень і тестування реакційних умов в малих масштабах. - Газові ферментери з рухоммим шаром: Це тип ферментера, де культура знаходиться на рухомому елементі, що обертається або рухається в реакторі. Це сприяє змішуванню і обміну газів та поліпшує ефективність процесу. - Аеробні та анаеробні ферментери: В залежності від вимог мікроорганізмів або клітин, газові ферментери можуть бути налаштовані для аеробних (з наявністю кисню) або анаеробних (без кисню) режимів культивування. - Мембранні ферментери: Цей тип газового ферментера використовує мембрану або полімерний матеріал для розділення газової фази від рідинної фази. Газ проникає через мембрану, забезпечуючи контрольовану передачу газу до культури, тоді як рідина залишається у ферментері. Це дозволяє забезпечити оптимальні умови для мікроорганізмів або клітин, зменшуючи вплив газу на рідину. - Вакуумні ферментери: Це тип газового ферментера, в якому забезпечується умовне середовище шляхом використання вакууму. Зниження тиску у ферментері дозволяє забезпечити контрольовану подачу газу до культури. Вакуум може використовуватися для змішування, вивільнення газів з культури або для створення специфічних умов росту. - Мультифазні ферментери: Це тип газового ферментера, в якому відбувається одночасне культивування кількох фаз, таких як газ, рідина і твердий матеріал. Наприклад, це може бути культивування мікроорганізмів на поверхні твердих частинок або пористих матеріалів у присутності газу та рідини. - Іммобілізовані ферментери: Цей тип газового ферментера використовує іммобілізовані мікроорганізми або клітини, які прикріплюються до носія, такого як гель, сітка, піна або тверді частинки. Гази проходять через носій, що забезпечує взаємодію мікроорганізмів або клітин з газовою фазою для реакцій [32]. Для вирощування Methylococcus capsulatus, метанотрофної бактерії, яка здатна окислювати метан, можуть бути використані кілька типів газових ферментерів котрі перераховувалися вище в контексті. Оптимальний тип ферментера залежить від кількох факторів, включаючи масштаб вирощування, кількість газу, необхідну для постачання, і ефективність обміну газів з мікроорганізмами. З урахуванням особливостей Methylococcus capsulatus, таких як його здатність до окислення метану, оптимальним типом ферментера може бути: - Пухирчасті (петлеві) ферментери забезпечують ефективне змішування і доставку метану до культури Methylococcus capsulatus. Пухирчасті струмені метану забезпечують розподілення газу по всьому об'єму ферментера і поліпшують обмін газів між метаном і мікроорганізмами. Це сприяє підтриманню оптимальних умов для росту та активності Methylococcus capsulatus, забезпечуючи достатню кількість метану. Крім того, пухирчасті ферментери можуть бути використані як великомасштабні системи, що підходять для промислового вирощування Methylococcus capsulatus. Вони також легкі у використанні та контролі, що дозволяє забезпечити стабільні умови культивування та оптимальну продуктивність [33]. Отже, пухирчастий ферментер може бути оптимальним вибором для вирощування Methylococcus capsulatus. Також слід навести додаткові переваги, а саме: 1. Ефективне змішування: Пухирчасті ферментери забезпечують інтенсивне змішування культури Methylococcus capsulatus. Це допомагає підтримувати однорідність умов росту та розподіл метану по всьому об'єму ферментера. Рівномірне змішування сприяє рівномірному росту мікроорганізмів і підвищує продуктивність. 2. Поліпшений обмін газів: Пухирчасті струмені метану, які формуються в пузирчастому ферментері, забезпечують ефективний обмін газів між метаном і Methylococcus capsulatus. Це важливо для забезпечення достатньої кількості метану для росту та метанотрофних процесів. Ефективний обмін газів допомагає знизити втрати метану та покращити використання його мікроорганізмами. 3. Легка масштабованість: Пухирчасті ферментери можуть бути легко масштабовані для вирощування Methylococcus capsulatus у великих масштабах. Це особливо важливо в промислових масштабах, де потрібно вирощувати значні обсяги мікроорганізмів для виробництва біопродуктів. 4. Контрольовані умови: Пухирчасті ферментери дозволяють забезпечити контрольовані умови культивування Methylococcus capsulatus. Параметри, такі як температура, pH, концентрація метану та інші фактори, можуть бути легко контрольовані та регульовані для оптимального росту і продуктивності мікроорганізмів [34]. 5.3. Обгрунтування вибору та опис стадій санітарної підготовки виробництва білка При виборі миючих та дезінфікуючих засобів на будь-якому підприємстві потрібно враховувати кілька ключових аспектів. По-перше, не можна застосовувати тривалий час один вид дезінфікуючого засобу, оскільки це може призвести до виникнення резистентної мікрофлори. Тому слід комбінувати та чергувати різні види миючих засобів. Зокрема, рекомендується змінювати дезінфікуючий засіб кожні два тижні або застосовувати кілька типів одночасно, що допоможе запобігти розвитку стійких штамів мікроорганізмів. При виборі підходящого дезрозчину варто орієнтуватися на кілька основних критеріїв: ціна, ефективність проти різних форм мікроорганізмів, доступність, токсичність, вплив на поверхні та матеріали, стійкість до умов навколишнього середовища, легкість у використанні та екологічність. Вартість засобу повинна відповідати бюджету підприємства, при цьому не жертвуючи ефективністю. Засіб повинен мати широкий спектр дії, включаючи бактерицидні та фунгіцидні властивості, щоб ефективно знищувати бактерії, гриби, віруси та інші патогенні мікроорганізми. Засіб має бути легко доступним для постійного постачання, щоб уникнути перебоїв у процесі дезінфекції [35]. Використовуваний засіб не повинен мати шкідливого впливу на організм людини. Важливо забезпечити, щоб концентрація активної речовини була достатньо ефективною, але при цьому безпечною для здоров'я працюючого персоналу. Дезінфікуючий засіб не повинен пошкоджувати оброблювані поверхні та матеріали. Слід враховувати сумісність з різними типами поверхонь, щоб запобігти корозії або деградації матеріалів. Засіб має бути ефективним в умовах, які характерні для конкретного підприємства, включаючи температуру, вологість та наявність органічних матеріалів, які можуть впливати на активність дезінфектанту. Препарат повинен бути зручним у застосуванні, включаючи простоту приготування робочих розчинів та можливість використання за допомогою стандартного обладнання для прибирання та дезінфекції. Перевага надається дезінфікуючим засобам, які є біорозкладними та не завдають шкоди навколишньому середовищу після використання [36]. Врахування всіх цих факторів дозволяє підприємству забезпечити ефективну дезінфекцію, мінімізуючи ризики для здоров'я персоналу та забезпечуючи стійкість проти широкого спектра мікроорганізмів. Крім того, регулярне чергування та комбінування різних дезінфікуючих засобів допомагає підтримувати високу ефективність санітарних заходів і запобігає розвитку резистентності серед патогенів . Обробка технологічних поверхонь Перекис водню (H2O2) Робоча концентрація дезінфікуючих розчинів на основі перекису водню може варіюватися від 3% до 30%, залежно від конкретних вимог та умов дезінфекції. Наприклад, для поверхневої дезінфекції, яка передбачає обробку різноманітних поверхонь, зазвичай використовують розчини з концентрацією 3%. Це пояснюється тим, що такий розчин виявляє високу ефективність у знищенні більшості мікроорганізмів, при цьому не викликає надмірної агресивності до матеріалів, які обробляються. Щодо норм витрат, вони визначаються відповідно до розмірів та типу поверхонь, які потребують дезінфекції. Загалом, для забезпечення ефективного очищення та дезінфекції важливо, щоб розчин достатньою мірою покривав усі поверхні та обладнання. Це дозволить гарантувати, що всі мікроорганізми на оброблюваних поверхнях будуть знищені, і процес дезінфекції буде максимально ефективним [37] Новохлор-екстра Робоча концентрація: Для підготовки дезінфікуючого розчину Новохлор-екстра рекомендується розведення в пропорції 0,5% - це означає 910 мл засобу на 10 літрів робочого розчину. Норми витрат: Поверхні рекомендується обробляти за допомогою ганчір’я, змоченого у розчині засобу в обсязі 100 мл на кожен квадратний метр поверхні. Рекомендований час дії для досягнення оптимального ефекту дезінфекції - 30 хвилин. Новохлор-екстра є відмінним універсальним засобом для дезінфекції, що містить гіпохлорит натрію та інші допоміжні компоненти, такі як мийні, ароматизуючі та антикорозійні речовини. Він ефективний проти широкого спектра мікроорганізмів та класифікується як помірно небезпечна речовина. Однією з особливостей Новохлор-екстра є те, що його розчини з активним хлором у відсотках від 0,01% до 0,1% можуть використовуватися в присутності осіб, які не займаються проведенням дезінфекційних робіт. Це робить його досить практичним для використання у таких місцях, як медичні установи, громадські приміщення та інші, де потрібна регулярна дезінфекція. Важливо також зазначити, що розчини Новохлор-екстра не завдають шкоди виробам з металу, скла, гуми, полімерних матеріалів, дерева, кераміки та різних покриттів. Це робить його універсальним засобом для використання в різних галузях, включаючи виробничі площі, медичні установи, громадські місця та інші. Його можна використовувати як вручну, так і для автоматизованих систем інтенсивного миття та дезінфекції [38]. Для ефективної обробки обладнання та миття резервуарів рекомендується використовувати спеціальні розчини, такі як розчини Ecolab та каустична сода. Ці засоби мають потужні властивості видалення забруднень та гарантують високий рівень гігієни, необхідний для забезпечення безпеки та якості продукції. Для забезпечення максимальної зручності та ефективності процесу миття, рекомендується використовувати систему автоматичної мийки CIP (Cleaning in Place). Цей метод дозволяє проводити процедуру миття автоматично, без необхідності вручного втручання. Використання CIP-мийки є перевагою, оскільки воно значно зменшує витрати миючих засобів на 20%-30% у порівнянні з об’ємом, який потрібно для процесу миття вручну, де витрати можуть становити до 50% об’єму. Такий підхід дозволяє ефективно використовувати ресурси та забезпечує високу якість очищення та дезінфекції обладнання, що є критичним для виробничих процесів та забезпечення безпеки продукції [38]. Біомой Склад цього засобу включає ряд активних компонентів: алкілбензолсульфонат натрію, що також відомий як сульфонол, присутній у концентрації від 5,0% до 8,0%, та лужну протеазу, яка міститься у концентрації від 1,0% до 1,1%. Крім того, до складу входять натрій карбонат, який може виступати як розчинник або буфер, диспергатор для рівномірного розподілу компонентів у розчині та наповнювач для забезпечення стабільності засобу. Призначення цього засобу включає дезінфекційне очищення різних видів виробів медичного призначення, що виготовлені з металу, скла, гуми та полімерних матеріалів. Серед таких виробів можуть бути жорсткі та гнучкі ендоскопи, медичні інструменти для гнучких ендоскопів, а також стоматологічні та хірургічні інструменти. Крім того, цей засіб може використовуватися для миття різних поверхонь приміщень, підлог, предметів догляду за хворими та предметів інтер'єру [39]. Застосування засобу розповсюджується на широкий спектр об'єктів і місць, включаючи навчально-виховні заклади, об'єкти комунально-побутового призначення, підприємства парфумерно-косметичної, мікробіологічної, харчової, переробної і фармацевтичної промисловості. Крім того, він застосовується в закладах ресторанного господарства і торгівлі, перукарнях, косметологічних салонах, аптеках, місцях тимчасового проживання та на транспорті. Цей широкий спектр застосування робить цей засіб надзвичайно універсальним для багатьох галузей та сфер діяльності [39]. Токсичність та безпечність: Біомой відноситься до помірно небезпечних речовин при введенні у шлунок, як це зазначено в ГОСТ 12.1.007 (3 клас небезпеки), та до мало небезпечних речовин при нанесенні на шкіру (4 клас небезпеки). Він не проявляє шкірно-резорбтивних, шкірно- подразнювальних та сенсибілізуючих властивостей. У своїй нативній формі, як порошок, може викликати подразнення слизової оболонки очей та верхніх дихальних шляхів. Проте при рекомендованих концентраціях він не подразнює слизову оболонку очей та верхніх дихальних шляхів. Не виявлено мутагенних, канцерогенних та ембріотоксичних властивостей (за діючою речовиною). Використання робочих розчинів Біомою для ручного та механізованого достерилізаційного очищення виробів медичного призначення не становить загрози надходження його компонентів у повітря робочої зони, оскільки він не містить летких компонентів. Робоча концентрація: Зазвичай робочий розчин Біомою має концентрацію 0,3%. Його використовують протягом доби після виготовлення, дотримуючись умов зберігання, щоб зберегти його ефективність. Невикористаний робочий розчин можна зберігати протягом 14 діб у тарі з щільно закритою кришкою.Норми витрат: 100 мл / м 2 . Для фармацевтичного обладнанні, що включають в себе змішувачі трубопроводів, псевдозріджені шари, резервуари та ємності для зберігання, рекомендується використовувати м'який лужний миючий засіб Ecolab COSA CIP 90. Склад цього засобу включає поверхнево-активну речовину та майже нейтральну формулу, що робить його придатним для чищення обладнання як вручну, так і за допомогою системи CIP. Важливо відзначити, що цей засіб супроводжується повним пакетом валідації, що включає методи визначення прийнятних залишкових рівнів та аналітичні методи кількісного визначення залишків. Це робить його надійним і безпечним для застосування в фармацевтичній промисловості, де високі стандарти якості та безпеки мають велике значення. Використання Ecolab COSA CIP 90 допомагає забезпечити відповідність стандартам та знижує ризик виникнення проблем з якістю продукції [41]. Обробка рук персоналу Засоби для дезінфекції рук, такі як "Стериліум" та "Неостерил М", є серед найпопулярніших у своєму класі. Однак, при виборі засобу для регулярного застосування необхідно враховувати як його ефективність у боротьбі з мікроорганізмами, так і його вплив на шкіру, зокрема збереження її здоров'я. "Стериліум" містить 2-пропанол, 1-пропанол та мецетроній етилсульфат. Ця комбінація компонентів робить його досить м'яким і ефективним у видаленні мікроорганізмів зі шкіри. За даними випробувань, "Стериліум" може зменшити кількість транзиторної мікрофлори на шкірі вдвічі всього за 30 секунд, і ця ефективність зберігається протягом години. Важливо також зазначити, що він не має подразнюючого впливу на шкіру та не порушує її водно-жировий баланс, а також має бактерицидну та фунгіцидну дію. "Неостерил М" містить неіоногенні і амфотерні поверхнево-активні речовини, полігексанід та зволожуючі компоненти. Цей засіб також відзначається широким спектром антимікробної дії, включаючи бактеріцидну, фунгіцидну та віруліцидну активність. Цей засіб класифікується як засіб 4-го класу небезпеки, але вважається безпечним для шкіри рук персоналу [41]. З урахуванням цих фактів, «Неостерил М» є оптимальним вибором для регулярної обробки рук персоналу, оскільки забезпечує ефективний захист від мікроорганізмів, при цьому м'яко діє на шкіру, зберігаючи її здоров'я та комфорт [42]. Для встановлення обсягів поверхонь для обробки використаємо специфікацію обладнання з його габаритними розмірами. У ферментаційному відділенні наявні інокулятори та виробничий ферментер на 0,3 м 3 . Висота ферментера становить близько 1,6 м, приймаємо висоту поверху – 3 м. Загальна площа приміщення, де встановлено дане обладнання становить 4 м × 3 м = 12 м 2 . Враховуючи, що поверхня стін даного приміщення теж підлягає миттю та дезінфекції на висоту 2,5 м, загальна площа обробки становитиме: ∑F = (4 м × 3 м) + (3 м + 3 м +4 м+4 м) ×2,5 м = 12 м 2 + 35 м 2 = 47 м 2 Загальний обсяг обладнання, яке підлягає миттю, становить: 10+30+100+300 = 440 л Оскільки при використанні СІР-мийки витрата становить 20% від обсягу обладнання, то поверхня для миття буде наступною: 440* 20% / 100% = 88 л Дані щодо розрахунків розглянутих миючих та дезінфікуючих засобів представлено у табл. 5.1. Таблиця 5.1 Дані щодо розрахунків розглянутих миючих та дезінфікуючих засобів Назва засобу Об’єкт миття та/або дезінфекції Концентрація робочого розчину, % Вартість 1 л (кг) мийного або дез. засобу, грн/л(кг) Вартість 1 л робочого розчину мийного або дез.засобу, грн/л Витрати робочого розчину, л/м2 Ефективність використання дез. розчину, Едз, грн/м2 Перекис водню Поверхні, стіни, вікна, двері, підлога 3% 91 2,73 0,1 0,03 Новохлор-екстра Поверхні, стіни, вікна, двері, підлога 0,5% 108 0,54 0,1 0,005 Біомой Обладнання 0,3% 459 1,37 0,1 0,01 5.4. Особливості підготовки і стерилізації поживного середовища для одержання посівного матеріалу і виробничого процесу Максимальний синтез біомаси (10,3 г/л) досягається за умов росту Methylococcus capsulatus (Bath) NCIMB 11132 з гетеротрофними бактеріями з на поживному середовищі з наступним складом, (г/л): - Газова суміш CH4: Повітря: CO2 -9:9:2 - MgSO4 × 7 H2O – 1; - KNO3 - 1; - CaCl2 × 2 H2O – 0,15; - CuSO4 × 5 H2O – 2,5 ; - Na2HPO4 × 12 H2O – 0,717; - KH2PO4 – 0,272. Виробничий біосинтез здійснюється у ферментері об’ємом 0.3 м 3 із коефіцієнтом заповнення 0,5. Підготовка посівного матеріалу відбувається у чотири етапи стадії (в колбах на качалках та 3 інокуляторах). 5.5. Розрахунок кількості стадій підготовки посівного матеріалу для біосинтезу одноклітинного білка M. capsulatus NCIMB 11132 Виробничий біосинтез здійснюють у газовому біореакторі об’ємом 300 л із коефіцієнтом заповнення 0,5. Робочий об’єм ферментера (Vроб) визначають за формулою: Vроб = Vг. ф. × Кзап, де: Vг. ф. – геометричний об’єм ферментера; Kзап – коефіцієнт заповнення. Vроб = 300 × 0,5 = 150 л. Кількість посівного матеріалу (доза) становить 35 % від об’єму поживного середовища, оскільки частка M. capsulatus складає 10 %, а A. acidovaorans становить 10% і по 7,5% Brevibacillus sp. і A. danicus [5]. Отже, для одержання 150 л культуральної рідини потрібно: Vроб. 1 = 150 × 0,35 = 52,5 м 3 посівного матеріалу. Таку кількість інокуляту можна одержати під час культивування бактерій у посівному апараті об’ємом 100 л. Для одержання 50 л культуральної рідини потрібно мати: Vроб. 2 = 50 × 0,35 = 17,5 л посівного матеріалу. Таку кількість посівного матеріалу можна одержати у процесі вирощування метилотрофного штаму в інокуляторі об’ємом 30 л. 15 л культуральної рідини можна одержати з використанням Vроб. 3 = 15 × 0,35 = 5,25 л посівного матеріалу. Приготування такої кількості інокуляту здійснюють в інокуляторі об’ємом 10 л. Для одержання 5 л культуральної рідини потрібно мати: Vроб. 4 = 5 × 0,35 = 1,75 л посівного матеріалу Таку кількість посівного матеріалу можна одержати у процесі вирощування метилотрофного штаму в інокуляторі об’ємом 10 л. Для одержання 1,75 л культуральної рідини потрібно мати: Vроб. 4 = 1,75 × 0,35 = 0,61 л посівного матеріалу Таку кількість інокуляту можна одержати культивуванням бактерій у колбах на качалці. Для зручності висновки стосовно кількості стадій і об’ємів підготовки посівного матеріалу представимо у вигляді таблиці 3.1. Таблиця 5.2 Результати розрахунку об’ємів ферментаційного обладнання для підготовки посівного матеріалу і виробничого біосинтезу Об’єм ферментера , л Коефіцієнт заповненн я Робочий об’єм ферментера , л Об’єм посівного матеріал у (10%), л Конденса т (10%), л Об’єм підготовки поживного середовища , л 300 0,5 150 52,5 15 111,1 100 50 17,5 10 37 30 15 5,25 3 11,1 10 5 1,75 0,5 3,7 3,5 1,75 0,61 – * 1,3 *Конденсат не враховано, оскільки стерилізація композицій поживного середовища відбуватиметься у колбах в автоклаві. 5.5. Особливості підготовки і стерилізації поживного середовища для вирощування інокуляту в колбах на качалках та інокуляторі на 10 л Для вирощування початкового посівного матеріалу використовують середовище, яке наведено у підрозділі 3.3. Стерилізація буде відбуватись в автоклаві, через невеликий об’єм поживного середовища. Зважаючи на режим стерилізації компонентів поживного середовища, поділимо його на наступні композиції: Композиція А: Газова суміш CH4: Повітря: CO2 -9:9:2 (підготовленна за рахунок газових фільтрів) Композиція Б: KNO3, KH2PO4 , Na2HPO4 × 12 H2O, (режим стерилізації: 131 °С, 40 хв, 0,15 МПа). Композиція В: MgSO4 × 7 H2O, CuSO4 × 5 H2O, CaCl2 × 2 H2O (режим стерилізації: 131 °С, 40 хв, 0,15 МПа). Газова суміш (композиція А) є не потребує стерилізації, її пропускають через газовий фільтр/катридж. KNO3, KH2PO4 , Na2HPO4 × 12 H2O (композиція Б) стерилізується при 131°С, 40 хв окремо від MgSO4 × 7 H2O, CuSO4 × 5 H2O, CaCl2 × 2 H2O для запобігання утворення нерозчинних осадів. MgSO4 × 7 H2O, CuSO4 × 5 H2O, CaCl2 × 2 H2O (композиція В) стерилізуються при 131 °С, 40 хв. Стерилізація композицій Б і В здійснюється в автоклаві. 5.6. Особливості підготовки і стерилізації поживного середовища для вирощування інокуляту у посівних апаратах на 30 і 100 л Для цих стадій поділ на композиції поживного середовища змінюється. Композицію Б готують в окремому збірнику, а стерилізують в інокуляторі (для зменшення ймовірності контамінації), процес стерилізації відбувається при рН 4,5, щоб уникнути випадання осаду. Для цього середовище підкислюють 6%-м розчином сульфатної кислоти. Композиція А: Газова суміш CH4: Повітря: CO2 -9:9:2 (підготовленна за рахунок газових фільтрів) Композиція Б: KNO3, KH2PO4 , Na2HPO4 × 12 H2O, MgSO4 × 7 H2O, CuSO4 × 5 H2O, CaCl2 × 2 H2O (режим стерилізації: 131 °С, 40 хв, 0,15 МПа). Газова суміш (композиція А) є не потребує стерилізації, її пропускають через газовий фільтр/катридж. 5.7. Особливості підготовки і стерилізації поживного середовища для виробничого біосинтезу у газовому біореакторі на 300 л На цій стадії поділ на композиції поживного середовища зберігається з попередніх стадій. Композицію Б готують в окремому збірнику, а стерилізують в інокуляторі (для зменшення ймовірності контамінації), процес стерилізації відбувається при рН 4,5, щоб уникнути випадання осаду. Для цього середовище підкислюють 6%-м розчином сульфатної кислоти. Композиція А: Газова суміш CH4: Повітря: CO2 -9:9:2 (підготовленна за рахунок газових фільтрів) Композиція Б: KNO3, KH2PO4 , Na2HPO4 × 12 H2O, MgSO4 × 7 H2O, CuSO4 × 5 H2O, CaCl2 × 2 H2O (режим стерилізації: 131 °С, 40 хв, 0,15 МПа). Газова суміш (композиція А) є не потребує стерилізації, її пропускають через газовий фільтр/катридж. РОЗДІЛ 6. СПЕЦИФІКАЦІЯ ОБЛАДНАННЯ Інформацію про обладнання, використовуване під час виробництва мікробного білка змішаною культурою, узагальнено та наведено у табл. 6.1. Такі апарати зображено у графічній частині роботи (апаратурна схема). Таблиця 6.1 Специфікація обладнання для одержання мікробного білка Позиц ія Найменування Кіл