Удосконалення технології пресового вилучення гарбузової олії за допомогою ферментних препаратів

Abstract

Як відомо, у світовій практиці на сьогоднішній день існує два загальновідомих способи вилучення олії з олієвмісної сировини: пресування – механічний віджим олії за допомогою пресу та екстракція – вилучення олії з матеріалу розчинником. Екстракційний спосіб є більш ефективним, він дозволяє вилучати більше олії з олійного матеріалу порівняно з пресовим методом. Однак, технологія екстракції передбачає використання органічних розчинників, що є небезпечним для життя та здоров’я людини, оскільки такі розчинники є вибухо- та пожежонебезпечними, а їх пари є токсичними, при вдиханні можуть викликати отруєння. Крім того, потрапляння їх парів у навколишнє середовище також є негативним явищем з точки зору екології, оскільки вони реагують із забруднюючими речовинами в повітрі та утворюють озонові і фотохімічні речовини. Олія, яку одержують методом екстракції, повинна обов’язково піддаватись рафінації, що зумовлює втрату нею більшості її біологічно цінних сполук. Водночас пресовий спосіб є більш екологічно чистим та пожежобезпечнішим, на відміну від екстракції, а також дозволяє зберегти цінні природні компоненти в одержаних оліях (особливо холодним пресуванням). Однак, пресовий метод не дозволяє повністю вилучити олію з олійного матеріалу, в ньому завжди залишається значний відсоток вмісту олії. Саме тому актуальним є пошук технологій, які б дозволили інтенсифікувати процес пресового вилучення олії, але при цьому не призвели до погіршення її якості. Серед таких технологій перспективною є обробка олійного матеріалу перед пресуванням гідролітичними ферментами з протеолітичною, целюлолітичною, геміцелюлолітичною та пектолітичною активністю, яка здатна не лише сприяти збільшенню виходу олії, а й підвищувати її харчову цінність за рахунок збільшення переходу в олію біологічно активних речовин олійного насіння, зокрема, таких як токофероли та фітостероли. Практичне значення одержаних результатів для олієжирової галузі полягає у розробленні технології обробки м’ятки гарбузового насіння сумішами ферментних препаратів із протеолітичною, целюлолітичною, геміцелюлолітичною та пектолітичною активністю для підвищення ефективності пресового вилучення олії. Традиційна технологія пресового вилучення олії з матеріалу зазвичай включає такі стадії як очищення насіння від домішок, відділення насіннєвих оболонок (за необхідності), подрібнення, волого-теплову обробку та пресування. В технології, запропонованій у даній роботі, передбачається суміщення стадії попередньої ферментативної обробки гарбузового насіння зі стадією його волого-теплової обробки. Відомо, що олія в клітинах насіння міститься у вигляді ліпідних тіл (олеосом), оболонка яких утворена складними сполуками білкової природи та представниками фосфоліпідів. В той же час олеосоми зовні захищені пектиновим і лігноцелюлозним матриксом клітинних стінок насіння. Ліпідні тіла в клітинах насіння «вплетені» в цитоплазматичну мембрану, яка складається з білків. Самі ж стінки клітин складаються переважно із лігніну та полісахаридів, таких як целюлоза, геміцелюлози, та пектини, однак містять також і значну кількість багатих гідроксипроліном глікопротеїнів та комплексів арабіногалактанів з протеїнами. Руйнування таких оболонок потребує значних витрат енергії, і тому для повного вилучення олії з матеріалу не достатньо дії лише механічних та фізичних сил. Гідролітичні ферменти є потужними каталізаторами біохімічних реакцій розпаду різних складних органічних сполук. Зокрема, препарати з протеолітичною активністю зумовлюють розпад білкових сполук, а також ліпопротеїдних комплексів, які є структурними компонентами клітинних мембран та оболонок олійних тіл. Водночас, препарати з целюлолітичною, геміцелюлолітичною та пектолітичною активністю каталізують руйнування відповідних їм полісахаридів, які є структурними компонентами стінок клітин олійного насіння. Крім того, під час ферментативного гідролізу руйнуються комплексні сполуки токоферолів та фітостеролів з полісахаридами насіння, що спричиняє проникнення цих біологічно цінних сполук у олійну фазу. Таким чином, обробка гарбузового насіння гідролітичними ферментами у поєднанні з традиційною технологією пресування може інтенсифікувати дію механічних та фізичних сил, спрямованих на максимальне руйнування структурних компонентів матеріалу та вивільнення з нього олії, а також підвищити біологічну цінність та антиоксидантні властивості одержаної олії за рахунок збільшення вмісту в ній токоферолів та фітостеролів. Високій окислювальній стійкості такої олії також сприяє зменшення вмісту в ній пероксидних сполук, що може бути спричинене інактивацією ліпоксигеназ насіння внаслідок їх гідролізу протеолітичними ферментами. На підставі проведеного літературного огляду встановлено, що гарбузова олія є надзвичайно цінним джерелом антиоксидантів та інших біологічно активних речовин, що обумовлює її корисні властивості у лікуванні та профілактиці багатьох захворювань. Існує велика кількість перспективних способів одержання олії з насіння гарбузів. Результати попередніх досліджень, проведених вченими для інших олійних культур підтверджують необхідність подальшого вивчення та вдосконалення ферментативної технології переробки рослинної сировини. Робоча гіпотеза дисертаційної роботи полягає в тому, що використання ферментативної обробки олійного насіння перед пресуванням дозволить збільшити вихід олії внаслідок інтенсифікації ферментами процесів руйнування клітинної структури олійного матеріалу. На підставі цього, основними завданнями роботи є дослідження дії протеолітичних, целюлолітичних, геміцелюлолітичних та пектолітичних ферментів на клітинну структуру насіння гарбузів, підбір оптимальних параметрів попередньої ферментативної обробки гарбузового насіння, визначення впливу технології на якість, склад та антиоксидантні властивості одержаної олії. Проведеними експериментальними дослідженнями в лабораторних умовах запропонована гіпотеза набула підтверджень відносно того, що за допомогою дії ферментів вдається досягти вищого ступеню руйнування клітинної структури олійного матеріалу та вивільнити більшу кількість олії, порівняно з традиційними методами вилучення олії, при цьому не спричинивши погіршення її якості та втрату нею біологічно цінних компонентів, та, водночас, покращивши її антиоксидантні властивості. На основі аналізу науково-технічної літератури, виконаних експериментальних досліджень, математичного моделювання та теоретичних узагальнень одержаних результатів виконано конкретне наукове завдання щодо удосконалення технології пресового вилучення олії з насіння гарбузів за допомогою біотехнологічних методів. За результатами проведених досліджень було визначено раціональні параметри обробки м’ятки насіння гарбуза звичайного кислою протеазою та целюлазою. Було встановлено, що застосування обробки м’ятки сумішшю цих ферментів, взятих у співвідношенні 7:3, відповідно, при рН 5,2 дозволяє одержати максимальний кількісний вихід олії (60,3 %) та максимальний вміст у ній токоферолів (208,53 мкг/г), порівняно з іншими зразками того самого олійного матеріалу, обробленого ферментами за інших умов або у контрольних умовах. Встановлено, що обробка насіння гарбуза звичайного ферментними препаратами із протеолітичною та геміцелюлолітичною активністю сприяє підвищенню ефективності вилучення з нього олії пресовим способом. Зокрема, значний вплив на ефективність пресового вилучення олії з гарбузового насіння було виявлено під час його обробки ферментною сумішшю Флавозим+Пентопан 500 BG при рН 5,2, вихід пресової олії при цьому збільшився на 10,7 %, порівняно з контрольним зразком. Проведеними дослідженнями впливу дії ферментів на клітинну структуру олійного матеріалу було доведено, що обробка гарбузового насіння окремими ферментами, такими як пепсин, папаїн, Віскозим, целюлаза та пектиназа, сприяла вилученню з нього олії методом «миттєвого збовтування», кількість «зруйнованих» клітин в усіх оброблених різними ферментами зразках насіння гарбуза голонасінного була вищою та варіювала в межах від 67,6 до 69,5 %, порівняно з кількістю «зруйнованих» клітин контрольних зразків (64,4 %). Визначено також, що всі варіанти попередньої обробки насіння гарбуза голонасінного сумішами цих ферментів призводять до збільшення кількості «зруйнованих» клітин порівняно з контрольними зразками. Найбільшу кількість «зруйнованих» клітин - 71,0 та 71,1 % - було виявлено у зразках, оброблених сумішами пепсин+Віскозим+пектиназа та пепсин+целюлаза+пектиназа, відповідно, що на 6,6 % більше, ніж у контрольних зразках. Встановлено, що збільшення кількості доданої ферментної суміші понад 1,8 % не призводить до збільшення кількості «зруйнованих» клітин. За результатами досліджень методом світлової мікроскопії було визначено, що найбільший вплив на мікроструктуру гарбузового насіння має попередня обробка ферментною сумішшю пепсин+Віскозим+пектиназа, що призводить до практично повного розщеплення та зникнення клітинних стінок зрізу насінини, руйнування олеосом та коагуляції вільної олії. Значного ефекту зміни мікроструктури клітин гарбузового насіння можна також досягти шляхом обробки окремим ферментним препаратом Віскозим, оскільки він вже є сумішшю різних ферментів (целюлази, β-глюканаза, геміцелюлази), що дозволяє зруйнувати значну частину клітин і вивільнити з них більшу частину олійних тіл. Встановлено, що попередня ферментативна обробка насіння гарбуза голонасінного ферментною сумішшю пепсин+Віскозим+пектиназа сприяє збільшенню виходу пресової олії на 7,0 % порівняно з контрольними зразками, а вихід олії, розрахований до загального вмісту олії в насінні, на 14,3 % вищий, ніж у контрольних зразках. Визначено основні технологічні параметри, які мають суттєвий вплив на процес пресування. Для оптимізації технологічного процесу було обрано такі фактори: кількість ферментної суміші для обробки насіння (%), кількість внесеної з ферментами вологи (%). Експериментальними дослідженнями визначено, що раціональними параметрами для попередньої ферментативної обробки насіння гарбузів сумішшю ферментних препаратів з протеолітичною та целюлолітичною активністю є: кількість внесеної ферментної суміші 0,6 % та кількість внесеної з ферментами вологи 35 % від маси насіння. Використання таких технологічних параметрів надало можливість вилучити 65,6 % олії, що майже на 6 % вище, ніж у зразкові, обробленому за тих самих умов без додавання ферментів. Обгрунтовано поліноміальну регресійну модель залежності кількісного виходу пресової олії від параметрів ферментативної обробки гарбузового насіння та побудовано поверхню відгуку функції. Встановлено, що попередня ферментативна обробка насіння гарбузів не має суттєвого впливу на фізико-хімічні показники якості та склад одержаної пресової олії, водночас сприяючи підвищенню її антиоксидантної активності, вираженої гасінням радикалів DPPH°, а також збільшенню вмісту в ній токоферолів та деякому збільшенню вмісту стигмастеролу, що зумовлює підвищення біологічної цінності такої олії. Розроблено апаратурно-технологічну схему та технологічну карту виробництва гарбузової олії методом однократного пресування із використанням попередньої ферментативної обробки м’ятки гарбузового насіння. It is known that in world practice today there are two well-known methods of extracting oil from oleaginous material: pressing - mechanical squeezing of oil using a press and extraction - extraction of oil from the material with a solvent. The extraction method is more efficient, as it allows extracting more oil from the oilseed material compared to the pressing method. However, the extraction technology involves the use of organic solvents, which is dangerous to human life and health, as such solvents are explosive and fire hazardous, and their vapors are toxic and can cause poisoning if inhaled. In addition, the release of their vapors into the environment is also a negative environmental impact, as they react with air pollutants to form ozone and photochemicals. Oil obtained by extraction must be refined, which causes it to lose most of its biologically valuable compounds. At the same time, the pressing method is more environmentally friendly and fireproof, unlike extraction, and also allows preserving valuable natural components in the resulting oils (especially by cold pressing). However, the pressing method does not allow for complete extraction of oil from the oilseed material, and a significant percentage of oil content always remains. That is why it is important to search for technologies that would intensify the process of pressing oil extraction, but would not lead to a deterioration in its quality. Among such technologies, the treatment of oilseeds before pressing with hydrolytic enzymes with proteolytic, cellulolytic, hemicellulolytic and pectolytic activity is promising, which can not only increase the yield of oil, but also increase its nutritional value by increasing the transfer of biologically active substances of oilseeds, in particular, such as tocopherols and phytosterols, to oil. The practical significance of the results obtained for the oil and fat industry is to develop a technology for processing pumpkin seed flakes with mixtures of enzyme preparations with proteolytic, cellulolytic, hemicellulolytic, and pectolytic activity to increase the efficiency of pressing oil extraction. The traditional technology of pressing oil extraction from the material usually includes such stages as seed cleaning from impurities, separation of seed hulls (if necessary), grinding, moisture and heat treatment, and pressing. The technology proposed in this paper involves combining the stage of enzymatic pretreatment of pumpkin seeds with the stage of their moisture and heat treatment. It is known that oil in seed cells is contained in the form of lipid bodies (oleosomes), the shell of which is formed by complex protein compounds and phospholipids. At the same time, the oleosomes are protected from the outside by the pectin and lignocellulose matrix of the seed cell walls. Lipid bodies in seed cells are "woven" into the cytoplasmic membrane, which consists of proteins. The cell walls themselves consist mainly of lignin and polysaccharides such as cellulose, hemicellulose, and pectin, but also contain a significant amount of hydroxyproline-rich glycoproteins and complexes of arabinogalactans with proteins. The destruction of such membranes requires significant energy expenditure, and therefore, mechanical and physical forces alone are not sufficient to fully extract oil from the material. Hydrolytic enzymes are powerful catalysts for biochemical reactions of the breakdown of various complex organic compounds. In particular, drugs with proteolytic activity cause the breakdown of protein compounds and lipoprotein complexes, which are structural components of cell membranes and oil body membranes. At the same time, preparations with cellulolytic, hemicellulolytic and pectolytic activity catalyze the destruction of their corresponding polysaccharides, which are structural components of oilseed cell walls. In addition, enzymatic hydrolysis destroys complex compounds of tocopherols and phytosterols with seed polysaccharides, which causes the penetration of these biologically valuable compounds into the oil phase. Thus, the treatment of pumpkin seeds with hydrolytic enzymes in combination with traditional pressing technology can intensify the action of mechanical and physical forces aimed at maximizing the destruction of the structural components of the material and the release of oil from it, as well as increase the biological value and antioxidant properties of the resulting oil by increasing the content of tocopherols and phytosterols. The high oxidative stability of such oil is also facilitated by a decrease in the content of peroxide compounds in it, which may be caused by the inactivation of seed lipoxygenases due to their hydrolysis by proteolytic enzymes. Based on the literature review, it was found that pumpkin seed oil is a very valuable source of antioxidants and other biologically active substances, which determines its beneficial properties in the treatment and prevention of many diseases. There are a large number of promising ways to produce oil from pumpkin seeds. The results of previous studies conducted by scientists for other oilseeds confirm the need for further study and improvement of the enzymatic technology of processing plant materials. The working hypothesis of the dissertation is that the use of enzymatic treatment of oilseeds before pressing will increase the oil yield due to the intensification of enzyme destruction of the cellular structure of the oilseed material. Based on this, the main objectives of the work are to study the effect of proteolytic, cellulolytic, hemicellulolytic and pectolytic enzymes on the cell structure of pumpkin seeds, to select optimal parameters of enzymatic pretreatment of pumpkin seeds, to determine the effect of the technology on the quality, composition and antioxidant properties of the resulting oil. Experimental studies in the laboratory have confirmed the proposed hypothesis that enzymes can achieve a higher degree of destruction of the cellular structure of the oil material and release more oil than traditional methods of oil extraction, without causing deterioration in oil quality and loss of biologically valuable components, and at the same time improving its antioxidant properties. Based on the analysis of scientific and technical literature, experimental studies, mathematical modeling, and theoretical generalizations of the results obtained, a specific scientific task was performed to improve the technology of pressing oil extraction from pumpkin seeds using biotechnological methods. Based on the results of the study, the rational parameters of the treatment of common pumpkin seed flakes with acid protease and cellulase were determined. It was found that the use of flakes treatment with a mixture of these enzymes, taken in a ratio of 7:3, respectively, at pH 5.2, allows to obtain the maximum quantitative yield of oil (60.3 %) and the maximum content of tocopherols (208.53 μg/g) in comparison with other samples of the same oil material treated with enzymes under other conditions or in control conditions. It was found that the treatment of common pumpkin seeds with enzyme preparations with proteolytic and hemicellulolytic activity increases the efficiency of oil extraction from them by the press method. In particular, a significant effect on the efficiency of pressing oil extraction from pumpkin seeds was found during its treatment with the enzyme mixture Flavourzyme+Pentopan 500 BG at pH 5.2, the yield of pressed oil increased by 10.7 % compared to the control sample. Studies of the effect of enzymes on the cellular structure of the oil material have shown that the treatment of pumpkin seeds with certain enzymes, such as pepsin, papain, Viscosym, cellulase and pectinase, contributed to the extraction of oil from them by the "instant shaking" method, the number of "destroyed" cells in all samples of naked pumpkin seeds treated with different enzymes was higher and ranged from 67.6 to 69.5 %, compared to the number of "destroyed" cells of control samples (64.4 %). It was also determined that all variants of pretreatment of naked pumpkin seeds with mixtures of these enzymes lead to an increase in the number of "destroyed" cells compared to control samples. The largest number of "destroyed" cells - 71.0 and 71.1 % - was found in the samples treated with mixtures of pepsin+Viscozyme+pectinase and pepsin+cellulase+pectinase, respectively, which is 6.6 % more than in the control samples. It was found that an increase in the amount of the added enzyme mixture above 1.8 % does not lead to an increase in the number of "destroyed" cells, which is probably due to the saturation of the active centers of the substrate with the enzyme. According to the results of light microscopy studies, it was determined that pretreatment with the enzyme mixture pepsin+Viscozyme+pectinase has the greatest effect on the microstructure of pumpkin seeds, leading to almost complete cleavage and disappearance of the cell walls of the seed section, destruction of oleosomes and coagulation of free oil. A significant effect of changing the microstructure of pumpkin seed cells can also be achieved by treatment with a separate enzyme preparation Viscozyme, since it is already a mixture of different enzymes (cellulase, β-glucanase, hemicellulase), which allows to destroy a significant part of the cells and release most of the oil bodies from them. It was found that the enzymatic pretreatment of naked pumpkin seeds with the enzyme mixture pepsin+Viscozyme+pectinase increases the yield of pressed oil by 7.0 % compared to control samples, and the oil yield calculated to the total oil content in the seeds is 14.3 % higher than in control samples. The main technological parameters that have a significant impact on the pressing process were determined. The following factors were chosen to optimize the technological process: the amount of enzyme mixture for seed treatment (%), the amount of moisture added with enzymes (%). Experimental studies have determined that the rational parameters for the enzymatic pretreatment of pumpkin seeds with a mixture of enzyme preparations with proteolytic and cellulolytic activity are: the amount of the enzyme mixture applied is 0.6 % and the amount of moisture applied with enzymes is 35 % of the seed weight. The use of such technological parameters made it possible to extract 65.6 % of oil, which is almost 6 % higher than in the sample processed under the same conditions without the addition of enzymes. The polynomial regression model of the dependence of the quantitative yield of pressed oil on the parameters of enzymatic treatment of pumpkin seeds was substantiated and the response surface of the function was constructed. It was found that the enzymatic pretreatment of pumpkin seeds has no significant effect on the physicochemical quality parameters and composition of the resulting pressed oil, while contributing to an increase in its antioxidant activity, expressed by the absorption of DPPH° radicals, as well as an increase in the content of tocopherols and a slight increase in the content of stigmasterol, which leads to an increase in the biological value of such oil. A hardware and technological scheme and a flow chart for the production of pumpkin seed oil by the method of single pressing using enzymatic pretreatment of pumpkin seed flakes have been developed.