Регуляція антимікробної та антиадгезивної активності поверхнево-активних речовин Nocardia vaccinii IMB B-7405

Abstract

Мікробні поверхнево-активні речовини (ПАР) завдяки комплексу фізико- хімічних (здатність до емульгування, зниження поверхневого та міжфазного натягу) та біологічних (антимікробна та антиадгезивна активність, здатність до руйнування біоплівок) властивостей є препаратами мультифункціонального призначення, перспективними для застосування в різних галузях промисловості та природоохоронних технологіях. Проте істотним недоліком цих продуктів мікробного синтезу є залежність їхніх властивостей від умов вирощування продуцентів, оскільки ПАР є вторинними метаболітами і синтезуються у вигляді комплексу подібних сполук, склад і співвідношення яких можуть змінюватися в різних умовах культивування. Згідно з даними літератури основними підходами до регуляції біологічної активності мікробних ПАР є їх постферментаційна хімічна модифікація, а також вдосконалення штамів-продуцентів методами метаболічної та генетичної інженерії. Дисертаційна робота присвячена розробці простіших, але не менш ефективних шляхів регуляції антимікробної та антиадгезивної активності поверхнево-активних речовин, синтезованих Nocardia vaccinii IMВ B-7405. У дисертаційній роботі показано, що виявлення потенційних активаторів і/або інгібіторів ключових ферментів біосинтезу компонентів комплексу мікробних ПАР, відповідальних за певні властивості, з наступною відповідною модифікацією складу поживного середовища дає змогу регулювати склад комплексу, а отже, й властивості цільового продукту. Так, встановлено, що у N. vaccinii IMВ B-7405 ключовим ферментом біосинтезу поверхнево-активних аміноліпідів, відповідальних за антимікробну активність ПАР, є НАДФ+-залежна глутаматдегідрогеназа, активаторами якої є катіони кальцію, натрію та калію. Підвищення у середовищі культивування штаму ІМВ В-7405 концентрації хлориду кальцію з 0,1 до 0,4 г/л чи додаткове внесення 0,5-1,0 г/л хлориду натрію, хлориду калію чи їх суміші супроводжувалося підвищенням НАДФ+- залежної глутаматдегідрогеназної активності у 1,5-3 рази, а також посиленням антимікробної та антиадгезивної активності синтезованих ПАР, мінімальні інгібуючі концентрації (МІК) яких щодо бактеріальних (Bacillus subtilis БТ-2, Escherichia coli ІЕМ-1, Staphylococcus aureus БМС-1) і дріжджових (Candida tropicalis PE-2, Candida albicans Д-6 Candida utilis БВС-65) тест-культур були в 1,8−125 разів нижчими, а адгезія тест-культур на абіотичних поверхнях, оброблених такими ПАР, в 1,1−1,6 разів нижчою порівняно з показниками, встановленими для поверхнево-активних речовин, одержаних на базовому на середовищі без додаткового внесення катіонів. Встановлено можливість регуляції біологічної активності ПАР в результаті спільного культивування N. vaccinii IMВ B-7405 з конкурентними бактеріями та дріжджами. Так, внесення у середовище вирощування N. vaccinii ІМВ В-7405 як живих, так і інактивованих клітин бактерій E. coli ІЕМ-1 чи B. subtilis БТ-2, або дріжджів роду Candida супроводжувалося синтезом ПАР з підвищеною антимікробною активністю: МІК щодо бактеріальних і дріжджових тест-культур бактерій були у 2-128 разів нижчими, ніж МІК ПАР, утворюваних на середовищі без індукторів. Адгезія тест-культур до абіотичних поверхонь, оброблених ПАР, синтезованими за наявності дріжджів була у 2-2,1 рази нижчою, а ступінь руйнування біоплівок у 2 рази вищим, ніж у разі використання поверхнево- активних речовин, одержаних на середовищі без індукторів. Показано, що за наявності ПАР N. vaccinii IMВ B-7405 у суміші з антибіотиками амікацином та цефтріаксоном, антифунгальними препаратами (ністатином або флуконазолом) спостерігали зниження у 2-63 рази мінімальної інгібуючої концентрації лікарських засобів щодо бактеріальних та дріжджовивих тест-культур відповідно. Поверхнево-активні речовини N. vaccinii IMВ B-7405 проявляли синергізм антимікробної активності з ефірними оліями чайного дерева, кориці та лемонграсу. МІК суміші ПАР з оліями щодо B. subtilis БТ-2, E. coli ІЕМ- 1, S. aureus БМС-1) та дріжджів роду Candida були у 4-78 разів нижчими, ніж для ефірних олій та ПАР відповідно. Деструкція біоплівок бактеріальних і дріжджових тест-культур за дії суміші ПАР (20-40 мкг/мл) і ефірних олій (20-40 мкг/мл) була в 1,3-2,9 разів вищою порівняно з використанням аналогічних концентрацій кожного компоненту окремо. Встановлено, що поверхнево-активні речовини, синтезовані N. vaccinii ІМВ В-7405, проявляли синергізм деструкції дріжджових та батеріальних біоплівок на силіконових трубках у суміші з ністатином, флуконазолом та ефірною олією чайного дерева (збільшення у 2-3 рази ступеня руйнування біоплівок порівняно з використанням монопрепаратів), що дає змогу розглядати їх як перспективні складові «антифунгальних» та «антибактеріальних замків». Одержані результати засвідчують можливість регуляції біологічної активності поверхнево-активних речовин N. vaccinii ІМВ В-7405 і можуть стати підгрунтям для розробки технології отримання ПАР залежно від галузі їх практичного використання. Microbial surface active substances (SAS, surfactants) due to a complex of physicochemical (ability to emulsify, decrease surface and interfacial tension) and biological (antimicrobial and antiadhesive activity, ability to biofilms destruction) properties are multifunctional preparations, promising for use in various industries and environmental technologies. However, a significant disadvantage of these microbial synthesis products is the dependence of their properties of producers growing conditions, since surfactants are secondary metabolites and synthesized as a complex of similar compounds, the composition and ratio of which can change under different cultivation conditions. According to the literature, the main approaches to the regulation of biological activity of microbial surfactants are their post-fermentation chemical modification, as well as the improvement of producer strains by methods of metabolic and genetic engineering. The dissertation is devoted to the development of simpler, but no less effective ways of regulation of antimicrobial and antiadhesive activity of surfactants synthesized by Nocardia vaccinii IMV B-7405. The dissertation shows that the detection of potential activators and / or inhibitors of key enzymes of the components microbial surfactant complex biosynthesis, responsible for certain properties, followed by appropriate modification of the nutrient medium composition allows to regulate the composition of the complex and, consequently, the properties of target product. Thus, it was found that the key enzyme of biosynthesis of N. vaccinii IMV B-7405 surface-active aminolipids - responsible for antimicrobial activity of surfactants is NADP+ -dependent glutamate dehydrogenase, the activators of which are cations of calcium, sodium and potassium. The increase of IMV B-7405 strain culture medium concentration of calcium chloride from 0.1 to 0.4 g/l or application additional of 0.5-1.0 g/l of sodium chloride, potassium chloride or there mixture was accompanied by an increase in NADP+-dependent glutamate dehydrogenase activity by 1.5-3 times, as well as enhancing the antimicrobial and antiadhesive activity of the synthesized surfactants, the minimum inhibitory concentrations (MIC) of which against to bacterial (Bacillus subtilis BT-2, Escherichia coli IEM-1, Staphylococcus aureus BMS-1) and yeast (Candida tropicalis PE-2, Candida albicans D-6 Candida utilis BVS-65) test cultures were 1.8−125 times lower, and the adhesion of test cultures on abiotic surfaces treated with such surfactants, 1.1−1,6 times lower compared to the established for surfactants obtained on the basis medium without additional introduction of cations. The possibility of surfactants regulating the biological activity as a result of co-cultivation of N. vaccinii IMV B-7405 with competing bacteria and yeast has been established. Thus, the introduction into N. vaccinii IMV B-7405 culture medium of both live and inactivated E. coli IEM-1 or B. subtilis BT-2 cells or yeast of the genus Candida was accompanied by the synthesis of surfactants with increased antimicrobial activity: MIC against bacterial and yeast test cultures were 2-128 times lower than MIC surfactants synthesized on medium without inducers. The adhesion of test cultures to abiotic surfaces treated with surfactants synthesized in the presence of yeast was 2-2.1 times lower, and the degree of destruction of biofilms was 2 times higher than in the case of surfactants obtained on medium without inducers. It was shown that in the presence of N. vaccinii IMV B-7405 surfactants in a mixture with antibiotics amikacin and ceftriaxone, antifungal drugs (nystatin or fluconazole) there was a decrease in 2-63 times the minimum inhibitory concentration of drugs against bacterial and yeast test cultures, respectively. Surfactants of N. vaccinii IMV B-7405 showed synergism of antimicrobial activity with tea tree, cinnamon and lemongrass essential oils. MIC mixtures of surfactants with essential oils against B. subtilis BT-2, E. coli IEM-1, S. aureus BMS-1) and yeasts of the genus Candida were 4-78 times lower than minimum inhibitory concentrations of essential oils and surfactants, respectively. Destruction of bacterial and yeast biofilms test cultures under the action of a mixture of surfactants (20-40 μg/ml) and essential oils (20-40 μg/ml) was 1.3-2.9 times higher compared to the use of similar concentrations of each component separately. It was found that surfactants synthesized by N. vaccinii IMV B-7405 showed synergism of yeast and bacterial biofilms destruction on silicone tubes in a mixture with nystatin, fluconazole and tea tree essential oil (2-3 times increase in the degree of destruction of biofilms compared using mono-drugs), which allows us to consider them as promising components of "antifungal" and "antibacterial locks". The obtained results testify to the possibility of regulating the biological activity of N. vaccinii IMV B-7405 surfactants and can become the basis for the development of technology for obtaining surfactants depending on the field of their practical use.