Використання дріжджів Saccharomyces cerevisiae для одержання наночасток срібла

Abstract

Біологічний спосіб синтезу дозволяє отримувати наночастки срібла (AgNPs) різної форми та розмірів, що досягається різними умовами біосинтезу, такими як зміна температури, pH, часу культивування, концентрації нітрату срібла та ін. Слід наголосити, що отримання AgNPs з використанням мікроорганізмів є екологічно чистим та економічно вигідним, оскільки відпадає необхідність у використанні токсичних та дорогих матеріалів, які застосовуються при хімічному і фізичному методах синтезу наночасток. На сьогодні встановлено ряд біологічних (антибактеріальна, протигрибкова, антивірусна, протипухлинна дія) та фізико-хімічних властивостей біогенних наночасток срібла, що дозволяють їх використовувати у медицині, харчовій промисловості, сільському господарстві, хімічній та нафтохімічній промисловості, електроніці та інших галузях. Найбільший практичний інтерес для біосинтезу наночасток срібла викликають дріжджі, зокрема, Saccharomyces сerevisiae, що є одними з найбільш досліджених і широко використовуваних у промисловості мікроорганізмів. Тому дисертація присвячена дослідженню можливості використання дріжджів S. cerevisiae для біогенного синтезу наночасток срібла та вивченню їх антибактеріальної та антиадгезивної активності У дисертаційній роботі реалізовано два способи біосинтезу наночасток срібла з використанням хлібопекарських дріжджів Saccharomyces cerevisiae М437 і Saccharomyces cerevisiae 71B. Перший спосіб: синтез AgNPs у супернатанті та безклітинному водному екстракті S. cerevisiae М437 (нітрат срібла для біосинтезу наночасток вносили безпосередньо у супернатант і безклітинний екстракт). Другий спосіб: синтез наночасток срібла відбувається у культуральній рідині S. cerevisiae 71B (для біосинтезу AgNPs нітрат срібла вносили на початку культивування S. cerevisiae 71B). Встановлено характеристики та досліджено стабільність в процесі зберігання розчинів наночасток срібла отриманих з використанням S. cerevisiae М437. При використанні супернатанту S. cerevisiae М437 синтезувались AgNPs сферичної форми з діаметром близько 15 нм. Індекс полідисперсності (PdI) їх розчинів становив 0,3; дзета-потенціал -13,6. Після зберігання упродовж 45 діб при 4 °С значення PdI збільшилось в 1,6 разів, а дзета-потенціалу на 11,7 %. Ці результати дають підставу припустити, що в процесі зберігання можлива зміна форми AgNPs, формування агломератів або відбуваються інші процеси, які протікають у розчині наночасток у процесі їх зберігання. Наночастки срібла, які були отримані при використанні безклітинного водного екстракту S. cerevisiae М437 мали овальну форму з розмірами 21,3×14,2 нм. Індекс полідисперсності розчину – 0,3, а дзета-потенціал – -13,7. Після зберігання спостерігали збільшення значення PdI лише в 1,3 рази та зменшення показника дзета- потенціалу на 29 %. Це говорить, що розчин наночасток срібла, які були синтезовані з використанням безклітинного екстракту є більш стабільним після зберігання за вказаних вище умов. Показано різницю у розмірах AgNPs при використанні різних методів дослідження (метод динамічного розсіювання світла – Zetasizer Nano ZS і трансмісивна електронна мікроскопія – TEM). Визначені розміри наночасток, що синтезувались з використанням безклітинного водного екстракту S. cerevisiae M437 при використанні ТЕМ були в середньому на 75 % менші за значення отримані з використанням Zetasizer Nano ZS. Досліджено діапазон концентрацій нітрату срібла (0,5-2 мМ) та встановлено ефективну концентрацію для біосинтезу AgNPs з використанням S. cerevisiae 71B. При використанні даного штаму дріжджів нітрат срібла вносили на початку культивування і наночастки срібла були синтезовані у культуральній рідині. Після чого працювали з розчинами AgNPs у супернатанті та дріжджовому екстракті. Встановлено, що найбільш ефективні концентрації нітрату срібла для біосинтезу AgNPs становлять 0,5 мМ і 1,0 мМ: для наночасток у безклітинному екстракті спостерігали збільшення у порівнянні з контролем оптичної густини у піку поглинання (400 нм) на 90 % та 118 %, а для наночасток у супернатанті – на 95 % та 68 % відповідно. В ході роботи встановлено антимікробну активність AgNPs, отриманих з використанням S. cerevisiae 71B. Найбільш ефективними виявились розчини наночасток, отримані при внесенні 1,5 мМ та 2,0 мМ нітрату срібла на початку культивування дріжджів. Антибактеріальна дія по відношенню до референс- штамів S. aureus ATCC 25923 та E. coli ATCC 25922, а також клінічних ізолятів S. aureus 1536 та K. pneumoniae 520 при використанні розчину AgNPs у супернатанті була у 6-36, а у безклітинному екстракті у 9-21 разів більшою у порівнянні з контролем. Показано антиадгезивну дію розчинів наночасток, що були отримані при використанні S. cerevisiae 71B. У діапазоні досліджуваних концентрацій нітрату срібла для біосинтезу AgNPs високу антиадгезивну дію мали розчини наночасток, що були отримані при внесенні 1,5 мМ та 2,0 мМ нітрату на початку культивування S. cerevisiae 71B. Розчини наночасток срібла у супернатанті та безклітинному екстракті знижували адгезію S. aureus ATCC 25923 та E. coli ATCC 25922, S. aureus 1536 на 82-96 % та 80-97 % відповідно. По відношенню для клітин K. pneumoniae 520 досліджувані розчини наночасток мали низьку антиадгезивну активність. Наведені у даній роботі способи біосинтезу наночасток срібла з використанням дріжджів S. cerevisiae та встановлені їх антимікробні властивості є підґрунтям для їх подальшого застосування в залежності від сфери практичного використання. The biological method of synthesis allows obtaining silver nanoparticles (AgNPs) of different shapes and sizes, which is achieved by different conditions of biosynthesis, such as a change in temperature, pH, cultivation time, concentration of silver nitrate, etc. It should be noted that the production of AgNPs using microorganisms is environmentally friendly and economically beneficial, since there is no need to use toxic and expensive materials used in the chemical and physical methods of nanoparticle synthesis. To date, a number of biological (antibacterial, antifungal, antiviral, antitumor effects) and physicochemical properties of biogenic silver nanoparticles have been established, allowing them to be used in medicine, food industry, agriculture, chemical and petrochemical industries, electronics and other industries. The greatest practical interest for the biosynthesis of silver nanoparticles is caused by yeast, in particular Saccharomyces cerevisiae, which is one of the most studied and widely used microorganisms in industry. Therefore, the dissertation work is devoted to the study of the possibility of using the yeast S. cerevisiae for the biogenic synthesis of silver nanoparticles and the study of their antibacterial and antiadhesive activity. In the dissertation work, two methods for the biosynthesis of silver nanoparticles were implemented using baking yeast Saccharomyces cerevisiae M437 and Saccharomyces cerevisiae 71B. The first method: the synthesis of AgNPs in the supernatant and cell-free aqueous extract of S. cerevisiae M437 (silver nitrate for the biosynthesis of nanoparticles was added directly to the supernatant and cell-free extract). The second method: the synthesis of silver nanoparticles occurs in the culture liquid of S. cerevisiae 71B (for the biosynthesis of AgNPs, silver nitrate was added at the beginning of cultivation of S. cerevisiae 71B). The characteristics and stability during storage of solutions of silver nanoparticles obtained using S. cerevisiae M437 were determined. Using the S. cerevisiae M437 supernatant, spherical AgNPs with a diameter of about 15 nm were synthesized. The polydispersity index (PdI) of their solutions was 0.3; zeta potential - 13.6. After storage for 45 days at 4 °С, the PdI value increased by 1.6 times, and the zeta potential by 11.7%. These results give reason to assume that in the process of storage, a change in the shape of AgNPs, the formation of agglomerates, or other processes occurring in the solution of nanoparticles during their storage are possible. Silver nanoparticles obtained using a cell-free aqueous extract of S. cerevisiae M437 had an oval shape with dimensions of 21.3 × 14.2 nm. The polydispersity index of the solution is 0.3, and the zeta potential is -13.7. After storage, an increase in the PdI value by only 1.3 times and a decrease in the zeta potential by 29% were observed. This suggests that the silver nanoparticle solution that was synthesized using the cell-free extract is more stable after storage under the above conditions. The difference in the size of AgNPs was shown using various research methods (dynamic light scattering method – Zetasizer Nano ZS and transmission electron microscopy – TEM). The determined sizes of nanoparticles synthesized using a cell- free aqueous extract of S. cerevisiae M437 using TEM were, on average, 75% smaller than those obtained using Zetasizer Nano ZS. The concentration range of silver nitrate (0.5-2 mM) was studied and the effective concentration for the biosynthesis of AgNPs using S. cerevisiae 71B was established. When using this yeast strain, silver nitrate was introduced at the beginning of cultivation, and silver nanoparticles were synthesized in the culture liquid. After that, we worked with solutions of AgNPs in the supernatant and yeast extract. It was found that the most effective concentrations of silver nitrate for the biosynthesis of AgNPs are 0.5 mM and 1.0 mM: for nanoparticles in a cell-free extract, an increase in optical density at the absorption peak (400 nm) by 90% and 18 for nanoparticles in supernatant, by 95% and 68%, respectively. In the course of the work, the antimicrobial activity of AgNPs obtained using S. cerevisiae 71B was established. The most effective were the solutions of nanoparticles obtained by adding 1.5 and 2.0 mM silver nitrate at the beginning of yeast cultivation. The antibacterial activity against the reference strains S. aureus ATCC 25923 and E. coli ATCC 25922, as well as the clinical isolates of S. aureus 1536 and K. pneumoniae 520, when using the AgNPs solution in the supernatant, was 6-3 9-21 times more compared with control. The antiadhesive effect of nanoparticle solutions obtained using S. cerevisiae 71B was shown. In the range of silver nitrate concentrations studied for the biosynthesis of AgNPs, a high antiadhesive effect was exerted by solutions of nanoparticles obtained by adding 1.5 mM and 2.0 mM nitrate at the beginning of cultivation of S. cerevisiae 71B. Solutions of silver nanoparticles in the supernatant and cell-free extract reduced the adhesion of S. aureus ATCC 25923 and E. coli ATCC 25922, S. aureus 1536 by 82-96% and 80-97%, respectively. In relation to K. pneumoniae 520 cells, the studied solutions of nanoparticles had low antiadhesive activity. The methods for the biosynthesis of silver nanoparticles using the yeast S. cerevisiae and the established antimicrobial properties presented in this work are the basis for their further application, depending on the scope of practical use.