Вплив біологічних індукторів на антимікробну та антиадгезивну активність поверхнево-активних речовин Acinetobacter calcoaceticus IMB B-7241

Abstract

Серед перспективних альтернатив традиційним антибіотикам - мікробні поверхнево-активні речовини (ПАР), які є поверхнево-активними вторинними метаболітами, що синтезуються бактеріями, дріжджами та мікроміцетами. Ці сполуки не тільки зменшують поверхневий/міжфазний натяг, але й проявляють широкий спектр біологічної активності щодо патогенних мікроорганізмів. На відміну від традиційних антибіотиків, які націлені на конкретні клітинні процеси, мікробні ПАР можуть руйнувати мембрани мікробних клітин, впливати на здатність клітин до прікріплення до поверхонь, запобігаючи початковому етапу адгезії, що призводить до утворення біоплівок. Більше того, було показано, що поверхнево-активні речовини, такі як рамноліпіди та ліпопептиди, диспергують сформовані біоплівки, ефективно руйнуючи захисний матрикс бактерій. У порівняльних дослідженнях ці мікробні поверхнево-активні речовини значно перевершили звичайні антибіотики у зменшенні біомаси біоплівки. Ця подвійна функціональність - знищення планктонних культур мікроорганізмів та запобігання або руйнування біоплівок - позиціонує поверхневоактивні речовини як привабливих кандидатів у боротьбі з медикаментознорезистентними інфекціями, пов'язаними з біоплівками. Важливо розуміти, що мікробні поверхнево-активні речовини зазвичай синтезуються як складні суміші споріднених молекул, а не як окремі сполуки. Точний склад і властивості цих метаболітів можуть суттєво відрізнятися залежно від штамупродуцента та умов культивування. Через таку мінливість, оптимізація умов ферментації є ключовим аспектом розробки ПАР для практичного використання. Це також означає, що використання біологічних індукторів (один із методів спільного культивування мікроорганізмів) можуть бути використані для сприяння виробництву 3 похідних з підвищеною антимікробною та антиадгезивною активністю. Таким чином, мікробні поверхнево-активні речовини є універсальними вторинними метаболітами, ефективність яких пов'язана не тільки з притаманними їм біологічно активними властивостями, але й з екологічними факторами (можливість використання промислових відходів у якості субстратів). Дисертаційна робота присвячена дослідженню регуляції біологічної активності (антимікробна, антиадгезивна та роль у руйнуванні бактеріальних та дріжджових біоплівок) поверхнево-активних речовин, синтезованих Acinetobacter calcoaceticus IМВ В-7241 на гліцерині різного ступення очищення (очищений та відходи виробництва біодизеля) разом із біологічними індукторами у вигляді прокаріотичних та еукаріотичних мікроорганізмів. Встановлено, що поверхнево-активні речовини A. calcoaceticus IMВ B-7241 незалежно від типу субстрату (очищений гліцерин, відходи виробництва біодизелю) та фізіологічного стану індуктора Bacillus subtilis БТ-2, Enterobacter cloacae C-8, чи Saccharomyces cerevisiae БТМ-1 (живі клітини, інактивовані клітини та відповідний супернатант) виявляли вищу біологічну активність (антимікробна, антиадгезивна, знатність до руйнування біоплівок) порівняно з поверхнево-активними речовинами, синтезованими внесення без індуктора. Поверхнево-активні речовини, синтезовані A. calcoaceticus IMВ B-7241 на середовищі з гліцерином різного ступенння очищення за внесення прокаріотичного індуктора B. subtilis БТ-2, у будь-якому фізіологічному стані мали значення мінімальних інгібуючих концентрацій щодо B. subtilis БТ-2, Staphylococcus aureus БМС-1, Escherichia coli ІЕМ-1, Pseudomonas sp. МІ-2 у діапазоні 0,23-18,4 мкг/мл, що значно нижче значення МІК без використання індукторів − 2,8-19,6 мкг/мл. При внесенні грамнегативного індуктора Enterobacter cloacae C-8 МІК поверхневоактивних речовин, синтезованих за їх наявності щодо B. subtilis БТ-2, S. aureus БМС1, E.coli ІЕМ-1, Pseudomonas sp. МІ-2 вдалося зменшити у 3-28 рази. Використання дріжджів Saccharomyces cerevisiae БТМ-1 як індуктора у середовищі культивування ПАР штаму IMВ B-7241 дозволило знизити мінімальні інгібуючі концентрації щодо 4 E. cloacae C-8, S. aureus БМС-1, B. subtilis БТ-2 та Proteus vulgaris ПА-12 з 16-56 до 0,85-19,2 мкг/мл. Поверхнево-активні речовини, синтезовані A. calcoaceticus IMВ B-7241 на середовищі з гліцерином різного ступення очищення за внесення прокаріотичних (B. subtilis БТ-2, E. cloacae C-8) та еукаріотичних (S. cerevisiae БТМ-1) типів індуктора дало змогу знизити МІК щодо дріжджів Candida albicans Д-6 та Candida tropicalis PE2 до 1,87-18,4 мкг/мл, 1-20 мкг/мл, 1,1 – 19,2 мкг/мл, або в 1,1 – 6 разів, 2-14 разів, 2,5 – 18,5 разів відповідно, порівняно з контролем. Результати антимікробної активності корелювали з активністю одного із ключових ферментів біосинтезу аміноліпідів в клітинах продуцента A. calcoaceticus IMВ B-7241, NADP⁺-залежної глутаматдегідрогенази: активість зростала у 1,5–2 рази порівняно з варіантом культивування штаму ІМВ В-7241 без індукторів, але тільки у середовищі, яке містило очищений гліцерин. У разі використання ПАР A. calcoaceticus IMВ B-7241, синтезованих на очищеному гліцерині, чи промислових відходах за внесення живих, інактивованих клітин B. subtilis БТ-2 чи супернатанта ступінь адгезії P. vulgaris ПА-12, B. subtilis БТ2, E. cloacae C-8, S. aureus БМС-1 та C. tropicalis PE-2, C. albicans Д-6 до сталі та лінолеуму, був 1,1-5.9 рази меншим, ніж при використанні аналогічних препаратів ПАР, синтезованих без внесення індукторів. За використання індуктора E. cloacae C8 при культивуванні A. calcoaceticus IMВ B-7241, ступінь адгезії бактеріальних та дріжджових культур до сталі, кахелю та лінолеуму був у 1,1-1,4 рази нижчим, порівняно з показниками, встановленими для ПАР, одержаних у середовищі без індуктора. За обробки ПАР, синтезованих штамом IMВ B-7241 з додаванням дріжджів S. cerevisiae БТМ-1 у різному фізіологічному стані адгезія P. vulgaris ПA-12, B. subtilis БT-2 та C. albicans Д-6 до сталі та кахелю була в 1,05-1,7 рази нижчою, порівняно із дією ПАР, одержаних без індуктора. Адгезія B. subtilis БT-2 та P. vulgaris ПA-12 до лінолеуму за аналогічних умов була у 1,2-1,6 рази нижчою за обробки ПАР без внесення індукторів. Ефективність руйнування бактеріальних E. coli ІЕМ-1, Pseudomonas sp. МІ-2, S. aureus БМС-1, B. subtilis БТ-2, P. vulgaris ПА-12 та дріжджових C. tropicalis PE-2 та 5 C. albicans Д-6 біоплівок за обробки їх ПАР, синтезованими штамом IMВ B-7241 на гліцерині різної якості (очищений, чи технічний) за наявності у середовищі продуцента індукторів E. cloacae C-8, B. subtilis БТ-2 та S. cerevisiae БТМ-1 різного фізіологічного стану, була 1,05-2,5 разів вищою у порівнянні з встановленою для контрольних ПАР, одераних без індукторів. Отже, внесення біологічних індукторів у середовище культивування продуцента ПАР дає змогу отримати не тільки високоефективні мікробні препарати з високої антимікробної, антиадгезивною активністю та здатністю до ефективного руйнування біоплівок тест-культур широкого спектра, а й допомагає вирішити екологічну проблему утилізації токсичних промислових відходів (відходи виробництва біодизеля). Microbial surfactants represent a set of promising alternatives to traditional antibiotics. These surface-active secondary metabolites are produced by bacteria, yeast, and fungi. They reduce surface/interfacial tension and exhibit a wide range of biological activities that can be used against pathogens. Unlike traditional antibiotics, which target specific cellular processes, microbial surfactants can break down microbial cell membranes and detach cells from surfaces. This prevents the initial stage of adhesion that leads to biofilm formation. Furthermore, the efficacy of surfactants such as rhamnolipids and lipopeptides in dispersing biofilms and disrupting the protective matrix of bacteria has been demonstrated through comparative studies, which have shown these microbial surfactants to significantly outperform conventional antibiotics in reducing biofilm biomass. This dual functionality, which targets both planktonic microbial cultures and biofilms, positions surfactants as attractive candidates in the fight against drug-resistant infections associated with biofilms. It is crucial to acknowledge that microbial surfactants are typically synthesized as complex mixtures of related molecules rather than as single compounds, with the exact composition and properties of these metabolites exhibiting significant variability depending on the producing strain and culture conditions. Because of this variability, optimizing fermentation conditions is a key aspect of developing surfactants for practical use. The employment of biological inductors (a method of co-cultivating microorganisms) has been demonstrated to enhance the production of microbial surfactants derivatives, which demonstrate heightened antimicrobial and antiadhesive properties. Consequently, microbial surfactants are a promising class of secondary metabolites, whose effectiveness is 18 determined by a multifaceted combination of biological activity and environmental factors, such as the utilization of industrial waste as substrates. The present dissertation is devoted to the study of the regulation of biological activity (antimicrobial, antiadhesive, and role in the destruction of bacterial and yeast biofilms) of surfactants synthesized by Acinetobacter calcoaceticus IMV B-7241 on glycerol of different degrees of purification (purified and crude glycerol) together with biological inductors in the form of prokaryotic and eukaryotic microorganisms. The study concluded that the surfactants A. calcoaceticus IMV B-7241 exhibited comparable biological activity regardless of the substrate type (purified glycerol or crude glycerol) or the inductor's physiological state Bacillus subtilis BT-2, Enterobacter cloacae C-8, or Saccharomyces cerevisiae BTM-1 (live cells, inactivated cells, and the corresponding cell-free extracts) exhibited higher biological activity (antimicrobial, antiadhesive, and biofilm destruction) compared to surfactants synthesized without an inductor. The surfactants synthesized by A. calcoaceticus IMV B-7241 on glycerol medium of various degrees of purification with the addition of the prokaryotic inductor Bacillus subtilis BT-2 in any physiological state had the values of minimum inhibitory concentrations against Bacillus subtilis BT-2, Staphylococcus aureus BMS-1, Escherichia coli IEM-1, Pseudomonas sp. MI-2 in the range of 0.23-18.4 μg/ml. This is significantly lower than the MIC value without the use of inductors, which ranged from 2.8-19.6. When the gramnegative inductor Enterobacter cloacae C-8 was introduced, the MIC of surface-active substances synthesized in its presence against Bacillus subtilis BT-2, Staphylococcus aureus BMS-1, Escherichia coli IEM-1, and Pseudomonas sp. MI-2 was reduced by 3-28 times. The utilization of the yeast Saccharomyces cerevisiae BTM-1 as an inductor in the surfactant culture medium of the IMV B-7241 strain resulted in a reduction of the minimum inhibitory concentrations against Enterobacter cloacae C- 8, Staphylococcus aureus BMS-1, Bacillus subtilis BT-2, and Proteus vulgaris PA-12 from 16-56 to 0.85-19.2 μg/ml. The synthesis of surfactants by A. calcoaceticus IMV B-7241 in a glycerol medium of varying degrees of purification, with the introduction of prokaryotic (B. subtilis BT-2, E. cloacae C-8) and eukaryotic (S. cerevisiae BTM-1) types of inductors, has been shown to 19 reduce the MIC against of Candida albicans D-6 and Candida tropicalis PE-2 were reduced to 1.87-18.4 μg/ml, 1-20 μg/ml, 1.1-19.2 μg/ml, or 1.1-6 times, 2-14 times, 2.5-18.5 times, respectively, compared to the control. The results of the antimicrobial activity were correlated with the activity of one of the key enzymes of aminolipid biosynthesis in the cells of the A. calcoaceticus IMV B-7241 producer, NADP+-dependent glutamate dehydrogenase: the activity increased by 1.5-2 times compared to the variant of cultivation of the IMV B-7241 strain without inductors, but only in the medium where the producer was cultivated with purified glycerol. In the context of investigating the effects of surfactants produced by A. calcoaceticus IMV B-7241, synthesized on purified glycerol or crude glycerol with the incorporation of live, inactivated Bacillus subtilis BT-2 cells or their culture extracts, the degree of adhesion of P. vulgaris PA-12, B. subtilis BT-2, E. cloacae C-8, S. aureus BMS-1, C. tropicalis PE2, and C. albicans D-6 to steel and linoleum was 1.1-5.9 times lower when using similar surfactant preparations synthesized without inductors. Furthermore, the use of the E. cloacae C-8 inductor for the cultivation of A. calcoaceticus surfactant IMV B-7241 led to a reduction in the degree of adhesion of bacterial and yeast cultures to steel, tile, and linoleum, with a range of 1.1-1.4 times lower compared to surfactants obtained in a medium without an inductor. Furthermore, when treating surfactants synthesized by IMV strain B-7241 with the addition of S. cerevisiae BTM-1 yeast in different physiological states, the adhesion of P. vulgaris PA-12, B. subtilis BT-2, and C. albicans D-6 to steel and tile was 1.05-1.7 times lower compared to the effect of surfactants obtained without inductor. Furthermore, the adhesion of B. subtilis BT-2 and P. vulgaris PA-12 to linoleum under comparable conditions was 1.2-1.6 times lower than that of surfactant treatments not containing inductors. The efficiency of destruction of bacterial E. coli IEM-1, Pseudomonas sp. MI-2, S. aureus BMS-1, B. subtilis BT-2, P. vulgaris PA-12 and yeast C. tropicalis PE-2 and C. albicans D-6 biofilms when treated with surfactants synthesized by strain IMV B-7241 on glycerol of different quality (purified, or crude) in the presence of the inductors E. cloacae C-8, B. subtilis BT-2 and S. cerevisiae BTM-1 of different physiological states in the producer medium was 1.05-2.5 times higher than that established for control surfactants treated without inductors. 20 Consequently, the introduction of biological inductors into the surfactant producer culture medium makes it possible to obtain not only highly effective microbial preparations with high antimicrobial, antiadhesive activity and the ability to effectively destroy biofilms of a wide range of test cultures, but also helps to solve the environmental problem of toxic industrial waste disposal (crude glycerol).