Біосинтез наночастинок селену молочнокислими бактеріями та їх застосування у харчових технологіях

Abstract

У багатьох регіонах світу, зокрема й у Європі, спостерігається дефіцит селену в раціоні населення, що зумовлює порушення антиоксидантного захисту організму та підвищення ризику розвитку низки захворювань. Існуючі форми селену, що застосовуються для корекції балансу мікроелементу, характеризуються або обмеженою біодоступністю або потенційною токсичністю при передозуванні. Тоді ж як наночастинки селену розглядаються як альтернативне джерело мікроелемента завдяки їх високій біологічній ефективності, та значно нижчій токсичності. Перспективним підходом до синтезу наночастинок селену є використання селенсинтезуючих молочнокислих бактерій, здатних до біотрансформації селеніту натрію у нано-форму селену з підвищеною біологічною ефективністю та безпечністю. Зазначений підхід характеризується високим рівнем безпеки, оскільки молочнокислі бактерії мають статус загальновизнаних безпечними (GRAS - Generally Recognized As Safe), а синтезовані ними наночастинки селену відзначаються оптимальними розмірами, формою та наявністю природних стабілізуючих агентів біологічного походження. Дисертаційна робота присвячена дослідженню факторів, що впливають на синтез наночастинок селену молочнокислими бактеріями, оптимізації процесів біотрансформації селеніту натрію у фракцію наночастинок селену, а також оцінці можливості використання отриманих наночастинок селену як добавки у складі харчових продуктів. Була підтверджена здатність до синтезу наночастинок різними представниками молочнокислих бактерій, зокрема штамами роду Lactobacillus (L. casei 3321, L. plantarum 3201, L. acidophilus 3103, L. delbrueckii subsp. bulgaricus 3511, L. brevis 3900, L. rhamnosus 3303), роду Lactococcus (L. lactis subsp. cremoris 1220, L. lactis subsp. lactis 1107), а також представниками родів Streptococcus, Bifidobacterium і Leuconostoc (S. thermophilus 2192; B. longum 4205, L. lactis 1404). Для досліджених штамів синтез наночастинок починався в експоненційну–стаціонарну фазу росту (24–48 год) і тривав до 72 годин (пізня стаціонарна фаза – фаза відмирання). Тому 72 години було визначено як оптимальний час длязавершення синтезу та виходу стабільних наночастинок із клітин. Окрім того, було продемонстровано, що використання як дешевого поживного середовища гідролізованого молока дозволяє за 48 годин забезпечити необхідну швидкість накопичення біомаси для всіх досліджених штамів – від 0,07 г×год-1 (L. plantarum 3201) до 0,42 г×год-1 (S. thermophilus 2192), що потенційно є підтвердженням їх стійкості до токсичного впливу селеніту натрію. Встановлено, що за 50 мкг/мл селеніту натрію в середовищі оптимальна кількість інокуляту, що необхідна для внесення на початку синтезу наночастинок, складає 10%, та дозволяє здійснювати біотрансформацію від 87,20 % (L. plantarum 3201) до 99,40 % (L. casei 3321) селеніту натрію, залежно від дослідженого штаму. При цьому зменшення кількості біомаси в порівнянні з контрольним зразком (без внесення селеніту натрію) в ході біосинтезу складає від 37,81 % (L. casei 3321) до 75,97 % (L. brevis 3900). За даної кількості інокуляту кількість фракції наночастинок серед усіх біосинтезованих форм селену становить від 17,61 % (L. brevis 3900) до 33,16 % (L. plantarum 3201). За внесення 1 та 5 % інокуляту продемонстровані показники синтезу були гіршими, тоді як підвищення до 15% не дало в загальному значного покращення, та за ключовими показниками було на нижчому рівні (зокрема, для концентрації синтезованих наночастинок та їх вмістом серед інших синтезованих форм селену). Дослідження концентрації внесеного в середовище селеніту натрію в діапазоні 50-250 мкг/мл найбільше вплинуло на кількість отриманих наночастинок. Зокрема, було встановлено що за оптимального рівня концентрації селеніту натрію, а саме 150 мкг/мл, концентрація синтезованих наночастинок збільшилась до 15-29 мкг/мл залежно від досліджуваного штаму, що складало 41-64 % серед усіх синтезованих сполук селену, тоді як за інших досліджених концентрацій значення кількості біосинтезованих наночастинок були нижчими. Проте, додавання селеніту натрію в концентрації вищої за 50 мкг/мл збільшило концентрацію залишкового селеніту натрію, зокрема кількість біотрансформованого селеніту зменшувалося від 87-99% (50 мкг/мл селеніту натрію) до 11-33 % (250 мкг/мл селеніту натрію). Також збільшення концентрації солі селеніту від 50 до 250 мкг/мл призводило до зменшення кількості накопиченої біомаси різними штамами порівняно з контролем (без додавання селеніту натрію) від 33-75% до 47-82% (залежно від штаму) відповідно. За оптимізації часу внесення селеніту натрію в середовище від моменту внесення інокуляту (L. plantarum 3201 – 6 год, L. delbrueckii subsp. bulgaricus 3511 – 0 год, S.thermophilus 2192 – 0 год, L. lactis subsp. cremoris 1220 – 2 год та B. longum 4205 – 3 год), а також швидкості перемішування середовища – 110 об/хв, було досягнуте додаткове підвищення концентрації наночастинок селену до рівня 27-32 мкг/мл, а також підвищення вмісту наночастинок селену до значень що складають 45-63 % серед усіх біосинтезованих сполук селену. Було встановлено, що використання двоштамових композицій може призвести до вищих рівнів синтезу SeNPs (selenium nanoparticles). Зокрема, поєднання штамів L. delbrueckii subsp. bulgaricus 3511 та L. lactis subsp. cremoris 1220 (композиція LBLC) дозволило збільшити сумарну синтезуючу здатність з досягненням концентрації наночастинок селену 38,92±0,23 мкг/мл, тоді як вміст селену у формі наночастинок склала 78,27 % від усіх біосинтезованих сполук селену. Композиції LBST (містить штами L. delbrueckii subsp. bulgaricus 3511 та S. thermophilus 2192) та LCST (L. lactis subsp. cremoris 1220; S. thermophilus 2192) мають меншу ефективність трансформації селеніту натрію в наночастинки селену ніж LBLC, але порівняно вищі ніж поодинокі штами, тоді як решта досліджених композицій (LPLB, LPLC, LPST, LPBL, LBBL, LCBL, STBL) продемонструвала нижчу здатність ніж монокультури. Продемонстровано, що готову біодобавку, яка містить наночастинки селену та біомасу молочнокислих бактерій можна використати в виробництві питного йогурту. Інактивація клітин молочнокислих бактерій, що входять в склад біодобавки, шляхом пастеризації біодобавки разом з молоком перед заквашуванням, дозволяє отримати більш стабілізований за показниками якості продукт, порівняно з внесенням в йогурт біодобавки з активними клітинами. Встановлено, що використання біодобавки LBLC+SeNPs (містить біомасу L. delbrueckii subsp. bulgaricus 3511 та L. lactis subsp. cremoris 1220 з наночастинками селену) в складі йогурту в кількості 10 %, 25% та 50% від рекомендованої добової норми селену разом з комерційним заквашу вальним препаратом дозволяє покращити реологічні показники продукту, що свідчить про підвищення синтезу екзополісахаридів штамами молочнокислих бактерій, що входять до складу заквашувального препарату. Зокрема ступінь відновлення структури гелю йогурту за внесення біодобавки було підвищено до 32-43% (залежно від концентрації) порівняно з 26 % у контрольному зразку, при цьому найкраще значення було характерно для біодобавки, що складає 10% від рекомендованої добової норми споживання селену (RDASe - Recommended Dietary Allowance of selenium). Результати аналізу синерезису та активної кислотності зразків йогурту підтвердило зменшення відділення сироватки при внесенні біодобавки, з оптимумом в концентрації 25% RDASe. Для цієї ж концентрації внесення біодобавки також характерним є підвищена концентрація клітин молочнокислих бактерій (2,23×1010 колонієутворювальних одиниць (КУО)) порівняно з іншими зразками йогурту (0,57×1010 -1,23×1010 КУО). Наявність наночастинок селену в складі біодобавки LBLC була підтверджена методом енергодисперсійної рентгенівської спектроскопії. На спектрограмі зафіксовано характерний пік з енергією близько 1,4 кеВ, що є типовим для біологічно синтезованого елементарного селену в аморфному стані. Окрім того, за енергетичними піками наявність в наночастинках серед елементів кисню, вуглецю та азоту підтверджує покриття наночастинок екзополісахаридами та білками. Оцінений на основі SEM (Scanning electron microscopy) середній розмір наночастинок селену складає 260,95 ± 70,88 нм. Тоді як мінімальний та максимальний розміри становлять 76 та 458 нм відповідно. У частотному розподілі частинок виявлено два піки в діапазонах 150–175 нм (фракція 11,05%) та 225–250 нм (фракція 17,4%). У розподілі за об’ємом зафіксовано пік у діапазоні 275–300 нм. Значення d10, d50 та d90 становили відповідно 232 нм, 313 нм та 400 нм. Аналіз впливу температури і часу витримки під час пастеризації (нагрів до 87°С та витримка протягом 3 хв) продемонстрували відсутність критичних змін розміру та форми наночастинок. Аналіз собівартості виробництва наночастинок в умовах лабораторії склав 0,23-1,17 грн (при дозі внесення 10%-50% рекомендованої норми вживання), що демонструє низьку вартість виробництва, зокрема від 0,5 % до 4,9 % від вартості готового продукту. In many regions of the world, including Europe, selenium deficiency in the human diet is observed, which leads to impairment of antioxidant defense mechanisms and an increased risk of developing a number of diseases. Existing forms of selenium used to correct micronutrient imbalance are characterized either by limited bioavailability or by potential toxicity in cases of overdose. In contrast, selenium nanoparticles are considered a promising alternative source of this micronutrient due to their high biological efficiency and significantly lower toxicity. A promising approach to the synthesis of selenium nanoparticles is the use of selenium-synthesizing lactic acid bacteria capable of biotransforming sodium selenite into a nano-form of selenium with enhanced biological efficacy and safety. This approach is characterized by a high level of safety, since lactic acid bacteria are generally recognized as safe (GRAS), and the selenium nanoparticles synthesized by them exhibit optimal size, morphology, and the presence of natural stabilizing agents of biological origin. The dissertation is devoted to the investigation of factors influencing the synthesis of selenium nanoparticles by lactic acid bacteria, optimization of sodium selenite biotransformation into the selenium nanoparticle fraction, and evaluation of the feasibility of using the obtained selenium nanoparticles as a functional additive in food products. The ability to synthesize selenium nanoparticles was confirmed for various representatives of lactic acid bacteria, including strains of the genus Lactobacillus (L. casei 3321, L. plantarum 3201, L. acidophilus 3103, L. delbrueckii subsp. bulgaricus 3511, L. brevis 3900, L. rhamnosus 3303), the genus Lactococcus (L. lactis subsp. cremoris 1220, L. lactic 1107), as well as representatives of the genera Streptococcus, Bifidobacterium, and Leuconostoc (S. thermophilus 2192; B. longum 4205; L. lactis 1404). For the investigated strains, nanoparticle synthesis began during the exponential– stationary growth phase (24–48 h) and continued up to 72 h (late stationary phase–cell death phase). Therefore, 72 h was determined as the optimal time for completion of synthesis and release of stable nanoparticles from the cells. In addition, it was demonstrated that the use of hydrolyzed milk as an inexpensive nutrient medium made it possible to ensure the required biomass accumulation rate for all studied strains within 48 h, ranging from 0.07 g/h (L. plantarum 3201) to 0,42 g/h (S. thermophilus 2192), which may indicate their tolerance to the toxic effects of sodium selenite. It was established that at a sodium selenite concentration of 50 μg/mL in the medium, the optimal inoculum size required at the beginning of selenium nanoparticles synthesis was 10%, allowing biotransformation of 87,20% (L. plantarum 3201) to 99.40% (L. casei 3321) of sodium selenite, depending on the strain. Under these conditions, biomass reduction compared to the control sample (without sodium selenite) ranged from 37,81% (L. casei 3321) to 75,97% (L. brevis 3900). At this inoculum level, the proportion of the nanoparticle fraction among all biosynthesized selenium forms ranged from 17,61% (L. brevis 3900) to 33,16% (L. plantarum 3201). The use of 1% and 5% inoculum resulted in lower synthesis efficiency, while increasing the inoculum to 15% did not lead to significant improvement and, for key indicators (notably nanoparticles concentration and their proportion among other selenium forms), showed lower performance. Investigation of sodium selenite concentration in the range of 50–250 μg/mL had the greatest influence on the amount of synthesized nanoparticles. In particular, it was found that at an optimal sodium selenite concentration of 150 μg/mL, the concentration of synthesized selenium nanoparticles increased to 15–29 μg/mL depending on the strain, accounting for 41–64% of all biosynthesized selenium compounds, whereas at other tested concentrations the nanoparticle yield was lower. However, increasing sodium selenite concentration above 50 μg/mL resulted in higher residual selenite levels, with the degree of biotransformation decreasing from 87–99% (50 μg/mL) to 11–33% (250 μg/mL). An increase in sodium selenite concentration from 50 to 250 μg/mL also led to a reduction in accumulated biomass compared to the control (without sodium selenite), from 33–75% to 47–82%, depending on the strain. Optimization of the time of sodium selenite addition relative to inoculation (L. plantarum 3201 – 6 h; L. delbrueckii subsp. bulgaricus 3511 – 0 h; S. thermophilus 2192 – 0 h; L. lactis subsp. cremoris 1220 – 2 h; B. longum 4205 – 3 h), as well as the agitation rate of 110 rpm, resulted in a further increase in selenium nanoparticles concentration to 27–32 μg/mL and an increase in their proportion to 45–63% of all biosynthesized selenium compounds. It was established that the use of dual-strain compositions can lead to higher levels of selenium nanoparticle synthesis. In particular, the combination of L. delbrueckii subsp. bulgaricus 3511 and L. lactis subsp. cremoris 1220 (LBLC composition) increased the total synthesis capacity, achieving a selenium nanoparticle concentration of 38.92 ± 0.23 μg/mL, with nanoparticles accounting for 78,27% of all biosynthesized selenium compounds. The LBST ( L. delbrueckii subsp. bulgaricus 3511 + S. thermophilus 2192) and LCST (L. lactis subsp. cremoris 1220 + S. thermophilus 2192) compositions showed lower efficiency than LBLC but higher efficiency than monocultures, while the remaining tested compositions (LPLB, LPLC, LPST, LPBL, LBBL, LCBL, STBL) demonstrated lower synthesis capacity than monocultures. It was demonstrated that a ready-to-use bioadditive containing selenium nanoparticles and lactic acid bacterial biomass can be applied in the production of drinking yogurt. Inactivation of lactic acid bacteria included in the bioadditive by pasteurization of the bioadditive together with milk prior to fermentation resulted in a product with improved quality stability compared to the addition of a bioadditive containing viable cells. It was established that incorporation of the LBLC+SeNPs bioadditive (containing L. delbrueckii subsp. bulgaricus 3511 and L. lactis subsp. cremoris 1220 biomass with selenium nanoparticles) into yogurt at levels corresponding to 10%, 25%, and 50% of the recommended daily allowance of selenium, together with a commercial starter culture, improved the rheological properties of the product, indicating enhanced exopolysaccharide synthesis by lactic acid bacteria of the starter culture. In particular, the yogurt gel structure recovery increased to 32–43% (depending on concentration) compared to 26% in the control sample, with the best result observed at 10% of the recommended daily allowance of selenium (RDAₛₑ). Syneresis and active acidity analysis confirmed reduced whey separation upon bioadditive incorporation, with an optimum at 25% RDAₛₑ. This concentration also resulted in a higher lactic acid bacteria cell count (2,23 × 10¹⁰ colony-forming units (CFU)) compared to other yogurt samples (0,57 × 10¹⁰– 1,23 × 10¹⁰ CFU). The presence of selenium nanoparticles in the LBLC bioadditive was confirmed by energy-dispersive X-ray spectroscopy. A characteristic peak at approximately 1,4 keV was observed, which is typical of biologically synthesized elemental selenium in an amorphous state. In addition, the presence of oxygen, carbon, and nitrogen peaks indicates surface coating of nanoparticles with exopolysaccharides and proteins. SEMbased analysis showed an average selenium nanoparticle size of 260.95 ± 70.88 nm, with minimum and maximum sizes of 76 and 458 nm, respectively. The number-based particle size distribution exhibited two peaks in the ranges of 150–175 nm (fraction 11.05%) and 225–250 nm (fraction 17.4%), while the volume-based distribution showed a peak in the range of 275–300 nm. The d10, d50, and d90 values were 232 nm, 313 nm, and 400 nm, respectively. Analysis of the effects of pasteurization temperature and holding time (heating to 87°C for 3 min) demonstrated the absence of critical changes in nanoparticle size and morphology. Cost analysis of laboratory-scale selenium nanoparticle production amounted to 0.23–1.17 UAH (at 10–50% of the recommended intake dose), demonstrating low production cost, corresponding to 0.5–4.9% of the final product cost.