Інтегрована технологій синтезу фітогормонів і поверхнево-активних речовин Nocardia vaccinii IMB B-7405, Acinetobacter calcoaceticus IMB B-7241 і Rhodococcus erythropolis IMB AC-5017

Abstract

Більшість дослідників прирозробцімікробних технологій дотримуються загально відомоїконцепції одержання одного продукту з використанням одного продуценту, акцентуючи увагу виключюно на одержанніосновного цільового продукту. У ту ж саму чергуможливістьштамів синтезувати різні метаболіти з багатьмабіологічними властивостями значно розширює область їх використанняу практиці. В сучасних умовах актуальності набувають комплексні мікробні препарати для рослинництва, яким притаманна ріст-стимулювальна та антимікробна активність завдяки наявності уїх складі фітогормонівта поверхнево-активних речовин (ПАР) відповідно. Виробництво таких препаратів стримується високими витратами на біосинтез та невисокою концентрацією фітогормонів у культуральнійрідині. Одним із шляхів, який може використовуватися дляінтенсифікації синтезу цільовихпродуктів, євнесення усередовище культивування продуцента екзогенних попередників біосинтезу. Для фітогормонів ауксинової природи таким попередником є триптофан. Крім того, одним з шляхів підвищення ефективностіінтегрованих мікробних технологій є використання як субстратів дешевих інаявних увеликих кількостях промислових відходів (відпрацьованої олії тавідході в виробництва біодизелю). Дисертаційна робота присвячена розробці на основі промислових відходів ефективної технології синтезу фітогормонів та поверхнево-активних речовин Acinetobacter calcoaceticusІМВ В-7241, Nocardia vaccinii ІМВ В-7405йRhodococcus erythropolis ІМВ Ас-5017 длявикористання у рослинництві. Встановлено можливість підвищення на кілька порядків концентрації фітогормонів ауксинової природи за наявності у середовищі, в якому культивували продуцентів поверхнево-активних речовинA. calcoaceticus ІМВ В-7241,N. vaccinii ІМВ В-7405йR. erythropolis ІМВ Ас-5017,з токсичними промисловими відходами (відпрацьована олія, відходи виробництва біодизелю) невисоких концентрацій триптофану -екзогенного попередника їх біосинтезу. Внесення у середовище, в якому культивували A. calcoaceticus ІМВ В-7241,R. erythropolis ІМВ Ас-5017 й N. vaccinii ІМВ В-7405 0,3 г/л триптофану супроподжувалося інтенсифікацією синтезу ауксинів у 27, 243 та 438 разів відповідно. Показано, що екзогенний триптофан залучається до біосинтезу ауксинів у досліджуваних продуцентів поверхнево-активних речовин через індол-3-піруватний шлях: активність триптофантрансамінази (вона є одним із ключових ферментів шляху синтезу індол-3-оцтової кислоти, який каталізує реакцію між триптофаном і 2-оксоглутаратом з утворенням індол-3-піровиноградної кислоти) підвищувалася у 2,3-5,4 разів порівняно з вирощуванням без попередника. Встановлено, що наявність триптофану у середовищі культивування A. calcoaceticus ІМВ В-7241, N. vaccinii ІМВ В-7405 й R. erythropolis ІМВ Ас-5017 не впливала синтез поверхнево-активних речовин, а їх антимікробна активність відносно фітопатогенних бактерій або підвищувалася, або залишалася без змін порівняно з встановленою для препаратів, синтезованих без попередника біосинтезу ауксинів. Вирощування N. vacciniiІМВ В-7405 і R. erythropolisІМВ Ас-5017 у середовищі з триптофаном супроводжувалося утворенням ПАР з підвищеною антимікробною активністю: мінімальні інгібуючі концентрації щодо фітопатогенних бактерій були у 2-4 рази вищепорівняно зтимипоказниками, які були встановленідля препаратів, що були синтезованібез попередника біосинтезу ауксинів. Показано, що збільшення антимікробної активності поверхнево-активних речовин штамів N. vaccinii ІМВ В-7405 й R. erythropolis ІМВ Ас-5017 корелювало із збільшенням в клітинах цих штамів НАДФ+-залежної глутаматдегідрогеназної активності – ключового ферменту біосинтезу аміноліпідів, які відповідають за антимікробну дію комплексу поверхнево-активних речовин. Встановлено, що обробка томатів, перцю та ячменю культуральною рідиною,супернатантом та фітогормональними екстрактами N. vaccinii ІМВ В-7405, A. calcoaceticus ІМВ В-7241, а також R. erythropolis ІМВ Ас-5017 супроводжувалася стимуляцією росту та розвитку рослин. Є перспективи для розробки на основі екзометаболітів N. vaccinii ІМВ В-7405 інтегрованої технології одержання комплексного мікробного препарату з ріст-стимулювальною та антимікробною щодо фітопатогенів активністю для застосування в рослинництві, ключовими елементами якої будуть використання як субстрату відпрацьованої соняшникової олії, що не потребує стерилізації, і внесення у середовище на стадії виробничого біосинтезу 0,3 г/л триптофану. Встановлено, що попередня обробка листя томатів у дослідженнях in vivo розчинами ПАР, що синтезуються N. vaccinii ІМВ В-7405 на середовищі, яке містило відпрацьовану олію та триптофан, на 100% зупиняла розвиток захворювання порівняно з листям, необробленим ПАР (ступінь ураження становив 8-50%). У разі обробки кореневої розсади томатів розбавленою у 400 разів культуральною рідиною і супернатантом, одержаним після вирощування бактерій N. vaccinii ІМВ В-7405 у середовищі, яке містило відпрацьовану олію і триптофан, приріст загальної ваги томатів і середньої ваги плоду підвищувався на 82-91 і 12-18% відповідно порівняно з обробкою водою. Використання як субстратів відпрацьованої олії та відходів виробництва біодизелю дає змогу не тільки отримати високоефективні комплексні мікробні препарати з ріст-стимулювальною та антимікробною щодо фітопатогенів активністю для використання у рослинництві,а й вирішує проблему утилізації цих токсичних промислових відходів. Most researchers in the process of developing microbial biotechnologies adhere to the generally accepted concept of "one producer – one product", focusing only on the synthesis of the target product. Nevertheless, the ability of strains to synthesize a complex of metabolites with different biological effects significantly expands the scope of their use in practice. In modern conditions, preparations for crop production, which have growth-stimulating activity due to the presence of phytohormones, and antimicrobial activity due to the presence of surface-active substances (surfactants), are gaining relevance. The production of such preparations is restrained by high costs of biosynthesis and relatively low concentrations of metabolites in the culture broth. According to the literature, one of the main approaches to increasing the concentration of the target product can be the introduction of biosynthesis precursors. For auxins, such a precursor is tryptophan. The dissertation is devoted to the development of an effective technology for the synthesis of phytohormones and surface-active substances of Nocardia vaccinii IMV B-7405, Acinetobacter calcoaceticus IMV B-7241, and Rhodococcus erythropolis IMV Ac-5017 for use in crop production with the aim of simultaneous toxic waste disposal. The possibility of increasing the concentration of phytohormones of auxin nature by several orders of magnitude in the presence of low concentrations of tryptophan (the exogenous precursor of their biosynthesis) in the cultivation medium of surfactant producers A. calcoaceticus IMV B-7241, N. vaccinii IMV B-7405 and R. erythropolis IMV As-5017 with toxic industrial waste (waste oil, biodiesel production waste) is established. The addition of 0.3 g/l tryptophan to the culture medium of A. calcoaceticus IMV B-7241, N. vaccinii IMV B-7405 and R. erythropolis IMV As-5017 was accompanied by the intensification of auxin synthesis by 27, 243, and 438 times, respectively. It was shown that exogenous tryptophan is involved in the biosynthesis of auxins in the studied producers of surfactants through the indole-3-pyruvate pathway: the activity of tryptophan transaminase (one of the key enzymes in the synthesis of indole-3-acetic acid, which catalyzes the reaction of the formation of indole-3-pyruvic acid from tryptophan and 2-oxoglutarate) increased by 2,3-5,4 times compared to cultivation without a precursor. It was established that the addition of tryptophan in the medium of R. erythropolis IMV As-5017, A. calcoaceticus IMV B-7241 and N. vaccinii IMV B- 7405 did not affect the level of synthesis of surfactants, and their antimicrobial activity against phytopathogenic bacteria (Pseudomonas syringae, Pseudomonas syringae pv. tomato, Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium carotovorum, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Xanthomonas vesicatoria) either increased or did not chanched compared to that data, established for preparations synthesized without a precursor of auxin biosynthesis. Cultivation of N. vaccinii IMV B-7405 and R. erythropolis IMV Ac-5017 in a medium with tryptophan was accompanied by the formation of surfactants with increased antimicrobial activity: the minimum inhibitory concentrations against phytopathogenic bacteria were 2-4 times higher compared to the indicators established for preparations synthesized without auxin biosynthesis precursor. The increase in antimicrobial activity correlated with an increase in the cells of these strains of NADP+-dependent glutamate dehydrogenase activity – the key enzyme in the biosynthesis of aminolipids, which are responsible for the antimicrobial activity of the surfactant complex. It was found that the treatment of tomatoes, pepper and barley with culture broth, supernatant and phytohormonal extracts of N. vaccinii IMV B-7405, A. calcoaceticus IMV B-7241 and R. erythropolis IMV As-5017 was accompanied by stimulation of plant growth and development. There are prospects for the building of an integrated technology for the preparation of a complex microbial preparation with ability to stimulate the plant growth and antimicrobial activity against phytopathogens for use in crop production, based on the exometabolites of N. vaccinii IMV B-7405. The key elements of the technology will be the use of waste sunflower oil as a substrate, which does not require sterilization, and introducing 0.3 g/l of tryptophan into the medium at the stage of production biosynthesis. On the basis of the exometabolites of N. vaccinii IMV B-7405, an integrated technology for obtaining a complex microbial preparation with growth-stimulating and antimicrobial activity against phytopathogens for use in crop production was developed, the key elements of which are the use of waste sunflower oil as a substrate, which does not require sterilization, and introduction of 0.3 g/l tryptophan into medium at the stage of production biosynthesis. It was established that pre-treatment of tomato leaves in studies in vivo with surfactant solutions isolated from this culture broth stopped the development of the disease by 100% compared to the leaves not treated with surfactants (the degree of damage was 8-50%).In the case of treatment of tomato root seedlings with a 400-fold diluted culture broth and supernatant after cultivation of N. vaccinii IMV B-7405 in a medium, which contained waste oil and tryptophan, the growth in the total weight and the average weight of tomatoes increased by 82-91 and 12-18%, respectively, compared with water treatment. The use of waste oil and waste from biodiesel production as substrates allows not only to obtain highly effective complex microbial preparations with ability to stimulate plant growth and antimicrobial activity against phytopathogens for use in crop production, but also solves the problem of disposal of these toxic industrial wastes.